TAT-血紅素氧合酶-1融合蛋白對大鼠供肝冷保存期肝細胞凋亡的影響.pdf

1、目的：肝移植術是治療終末期肝病的有效方法，但器官冷保存期間的冷缺血損傷是導致移植肝臟功能衰竭或早期無功能的主要原因。細胞凋亡在肝臟冷缺血再灌注損傷中起重要作用，最近研究表明肝竇內(nèi)皮細胞（SECs）較肝實質(zhì)細胞對冷缺血再灌注損傷更敏感。蛋白轉導結構域（PTDs）是一小段可以直接透過細胞膜的多肽，蛋白質(zhì)或多肽與PTDs相連后可進入細胞內(nèi)發(fā)揮生物功能。HIV-1反式激活蛋白（TAT）是目前研究較多的PTDs之一。TAT可將與其相連的蛋白轉導入

2、肝、腎、心肌以及腦等器官組織。血紅素氧合酶-1（HO-1）是機體血紅素分解代謝的限速酶，具有抗凋亡，抗氧化、抗炎癥等作用。已有研究證實，TAT與HO-1的融合蛋白（TAT-HO-1）可以成功轉導進入胰腺βTC-3細胞，并可顯著提高細胞活力。是否能利用TAT將HO-1轉導入肝細胞，用以減輕肝臟冷保存期間肝細胞的損傷尚有待進一步探討。
　　 本研究通過觀察大鼠肝臟冷保存期間肝組織HO-1含量、保存液中谷丙轉氨酶（ALT）水平、肝組織

3、內(nèi)皮素（ET）和透明質(zhì)酸（HA）水平、肝實質(zhì)細胞和SECs凋亡以及凋亡調(diào)控蛋白Bcl-2和Bax表達水平的變化，探討TAT-HO-1是否可以在冷保存期間轉導進入肝臟并發(fā)揮保護作用，為實現(xiàn)臨床應用蛋白轉導技術減輕供肝冷保存期損傷奠定基礎。
　　 方法：將HO-1 cDNA編碼區(qū)與合成的TAT-PTD片斷連接到原核表達載體pET32a上。構建TAT-HO-1-pET32a質(zhì)粒，經(jīng)測序鑒定后，轉化E.coli BL-21（DE3）菌株

4、，IPTG誘導表達、Ni-NTA-agarose純化，Western blot法對TAT-HO-1進行定性分析，化學法檢測TAT-HO-1活性，證實所得蛋白為有活性的TAT-HO-1融合蛋白后進行動物實驗。
　　 選擇雄性SD大鼠48只，體重250～300g。根據(jù)所用保存液的不同按照隨機數(shù)字表分為兩組（n=24）：C組，肝臟應用4℃HTK液進行灌注和冷保存；P組，肝臟應用4℃含TAT-HO-150μg/ml的HTK液進行灌注和冷

5、保存。參照Kamada等的方法切取肝臟。取下肝臟置于相應保存液40ml中4℃保存。
　　 各組分別于冷保存0h、6h、12h和18h隨機選取6個肝臟，抽取保存液置于4℃冰箱保存，切取肝組織標本立即置于-80℃冰箱保存，應用免疫組化染色法檢測肝臟組織HO-1含量，分析TAT-HO-1轉導進入肝臟的情況，全自動生化分析儀測定保存液中谷丙轉氨酶（ALT）水平，放射免疫分析法檢測肝臟組織ET和HA含量。原位末端脫氧核苷酸轉移酶標記（TU

6、NEL）法分別檢測肝實質(zhì)細胞和SECs凋亡，同時采用免疫組化染色法測定凋亡調(diào)控蛋白Bcl-2和Bax的表達水平。
　　 結果：
　　 1、免疫組化染色結果顯示兩組冷保存6h、12h、18h時肝實質(zhì)細胞和SECs中均可見明顯棕黃色HO-1陽性染色分布，P組各時點肝組織中HO-1含量均高于C組（P<0.05）。
　　 2、兩組保存液中ALT水平隨保存時間延長而升高（P<0.05），冷保存6h，12h和18h時保存液中

7、ALT水平均低于C組（P<0.05）。兩組肝組織ET和HA含量隨保存時間延長而升高（P<0.05），冷保存6h，12h和18h時肝組織中ET和HA含量，P組均低于C組（P<0.05）。
　　 3、肝實質(zhì)細胞和SECs凋亡率均隨保存時間延長而升高（P<0.05）。冷保存6h，12h和18h時，肝實質(zhì)細胞和SECs凋亡率P組均低于C組（P<0.05）。
　　 4、兩組Bcl-2、Bax均有表達，冷保存6h，12h和18h時，