血紅素氧合酶的干預(yù)對(duì)糖尿病大鼠結(jié)腸動(dòng)力障礙及Cajal間質(zhì)細(xì)胞的影響.pdf

1、糖尿病(diabetes mellitus，DM)結(jié)腸動(dòng)力障礙是DM極為常見的并發(fā)癥之一，現(xiàn)有的研究主要集中于神經(jīng)、胃腸激素以及血管病變上，但其發(fā)病機(jī)制目前仍未明確，臨床也缺乏有效的治療手段。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，血紅素氧合酶(heme oxygenase，HO)催化血紅素分解產(chǎn)生的內(nèi)源性一氧化碳(carbon monoxide，CO)是一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，在胃腸運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮重要作用；Cajal間質(zhì)細(xì)胞(interstitial cells of

2、 Cajal，ICC)是胃腸道起搏細(xì)胞，還可介導(dǎo)神經(jīng)遞質(zhì)的產(chǎn)生和作用。探討HO與ICC在DM慢傳輸型結(jié)腸動(dòng)力障礙發(fā)病機(jī)制中的作用，可為尋找該病新的治療方法提供理論依據(jù)。 [目的] 1．探討HO的干預(yù)對(duì)DM大鼠結(jié)腸動(dòng)力障礙的影響。 2．探討HO的干預(yù)對(duì)DM大鼠結(jié)腸ICC的影響。 3．探討HO的干預(yù)后DM大鼠結(jié)腸組織中c-kit與HO-2/HO-1共表達(dá)的情況。 [方法] 1．動(dòng)物模型的建立及

3、干預(yù)：SD 大鼠一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(60mg/kg)建立DM模型。SPF環(huán)境飼養(yǎng)6周時(shí)以碳末推進(jìn)實(shí)驗(yàn)測(cè)量其胃腸推進(jìn)率，證實(shí)DM大鼠存在慢傳輸型胃腸動(dòng)力障礙。隨后，剩余大鼠分為：①正常對(duì)照組(健康大鼠)，②DM未干預(yù)組，以上2組均予磷酸鹽緩沖液(PH=7.4)，隔日腹腔注射×3周；③DM+Hemin組：予HO的誘導(dǎo)劑Hemin(30umol/kg)隔日腹腔注射×3周；④DM+ZnPP組：予HO的阻滯劑ZnPP Ⅸ(10umol/kg

4、)隔日腹腔注射×3周；監(jiān)測(cè)體重、血糖。 2．干預(yù)3周后(即9周時(shí))，Western blot檢測(cè)近、遠(yuǎn)端結(jié)腸組織HO的表達(dá)，免疫組化標(biāo)記HO陽(yáng)性細(xì)胞，分析HO陽(yáng)性細(xì)胞的分布和面積變化，以此驗(yàn)證干預(yù)的有效性。 3．碳末推進(jìn)實(shí)驗(yàn)測(cè)量大鼠胃腸推進(jìn)率。 4．取近、遠(yuǎn)端結(jié)腸環(huán)、縱行平滑肌條，以離體肌條實(shí)驗(yàn)記錄其自發(fā)收縮的頻率、振幅及對(duì)Ach的反應(yīng)性。 5．westem blot檢測(cè)近、遠(yuǎn)端結(jié)腸組織c-kit(IC

5、C的特異性受體)蛋白的表達(dá)，免疫組化標(biāo)記ICC，分析ICC的分布和面積的變化。 6．雙重免疫熒光同時(shí)標(biāo)記c-kit與HO-2、c-kit與HO-1，觀察c-kit與HO的共表達(dá)情況。 [結(jié)果] 1．6周時(shí)，DM大鼠胃腸推進(jìn)率較正常大鼠顯著降低(P<0.05)，證實(shí)DM大鼠慢傳輸型胃腸動(dòng)力障礙模型形成。 2．干預(yù)后(即9周時(shí))，與正常對(duì)照組相比，DM未干預(yù)組、DM+Hemin組和DM+ZnPP組大鼠體重均顯

6、著下降(P<0.05)，血糖均顯著升高(P<0.05)；但該3組DM大鼠之間體重、血糖無(wú)顯著差異(P>0.05)。 3．干預(yù)后，Westem blot及免疫組化結(jié)果顯示： ①HO-2的表達(dá)及陽(yáng)性細(xì)胞面積：近端結(jié)腸DM未干預(yù)組、DM+Hemin組和DM+ZnPP組間無(wú)顯著差異(P>0.05)，但均低于正常對(duì)照組(P<0.05);遠(yuǎn)端結(jié)腸各實(shí)驗(yàn)組間無(wú)顯著差異(P>0.05)。 ②HO-1的表達(dá)及陽(yáng)性細(xì)胞面積：近、遠(yuǎn)端

7、結(jié)腸，正常對(duì)照組與DM未干預(yù)組無(wú)顯著差異(P>0.05)，DM+Hemin組表達(dá)較前兩組顯著增多(P<0.05)，DM+ZnPP組HO-1基本無(wú)表達(dá)(P<0.05)。 ③HO陽(yáng)性細(xì)胞的分布：免疫組化顯示大鼠結(jié)腸組織中HO-1和HO-2陽(yáng)性細(xì)胞主要分布于肌間神經(jīng)叢和黏膜下神經(jīng)叢，以肌間神經(jīng)叢為著，環(huán)肌和縱肌內(nèi)亦有少量分布。 4.干預(yù)后的胃腸推進(jìn)率：DM未干預(yù)組較正常對(duì)照組顯著降低(P<0.05)；DM+Hemin組較DM未

8、干預(yù)組顯著降低(P<0.05)；DM+ZnPP組較DM未干預(yù)組顯著改善(P<0.05)，并與正常對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)。 5.干預(yù)后，近端遠(yuǎn)端結(jié)腸環(huán)、縱行平滑肌條自發(fā)收縮的頻率、振幅及對(duì)Ach的反應(yīng)性：DM未干預(yù)組較正常對(duì)照組顯著下降(P<0.05)；DM+Hemin組較DM未干預(yù)組顯著降低(P<0.05)；DM+ZnPP組較DM未干預(yù)組顯著改善(P<0.05)，部分指標(biāo)達(dá)到正常對(duì)照組水平。 6.干預(yù)后，Wes

9、tem blot及免疫組化顯示近、遠(yuǎn)端結(jié)腸c-kit蛋白表達(dá)及陽(yáng)性細(xì)胞面積：DM未干預(yù)組較正常對(duì)照組顯著減少(P<0.05)；DM+Hemin組較DM未干預(yù)組稍減少，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；DM+znPP組較DM未干預(yù)組顯著增多(P<0.05)，且與正常對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)。免疫組化顯示結(jié)腸c-kit陽(yáng)性細(xì)胞分布與HO陽(yáng)性細(xì)胞分布部位一致。 7.干預(yù)后，雙重免疫熒光顯示，大鼠結(jié)腸組織c-kit陽(yáng)性細(xì)胞與HO-

10、2陽(yáng)性細(xì)胞、c-kit陽(yáng)性細(xì)胞與HO-1陽(yáng)性細(xì)胞均在同一部位表達(dá)。 [結(jié)論] 1.造模6周時(shí)，DM大鼠慢傳輸型胃腸動(dòng)力障礙模型形成。 2．Hemin和ZnPP Ⅸ對(duì)HO的干預(yù)對(duì)DM大鼠體重、血糖無(wú)顯著影響。 3．HO的干預(yù)對(duì)DM大鼠結(jié)腸HO-2的表達(dá)無(wú)顯著影響，僅影響了結(jié)腸HO-1的表達(dá)：Hemin誘導(dǎo)其表達(dá)上調(diào)；ZnPP Ⅸ阻滯了其表達(dá)。 4．HO的干預(yù)能影響DM大鼠慢傳輸型結(jié)腸動(dòng)力障礙：Hem

11、in對(duì)HO-1的誘導(dǎo)可能使其加重；ZnPP Ⅸ對(duì)HO-1的阻滯可能使其改善。 5．ZnPP Ⅸ可能通過(guò)阻滯HO-1，對(duì)DM大鼠結(jié)腸ICC起一定的保護(hù)作用。 6．ICC可能合成一氧化碳(carbon monoxide，CO)，并介導(dǎo)CO在胃腸運(yùn)動(dòng)中的重要作用。 7．結(jié)腸組織HO與ICC的變化、及其相關(guān)性，可能是DM慢傳輸型結(jié)腸動(dòng)力障礙的原因之一；也可能是“HO干預(yù)”導(dǎo)致DM慢傳輸型結(jié)腸動(dòng)力障礙“改善或加重”的機(jī)制之