微泡增強(qiáng)的超聲空化阻斷肝臟和肝腫瘤微循環(huán)的實(shí)驗研究.pdf

1、惡性腫瘤是嚴(yán)重威脅人類生命健康的疾病，其治療一直是醫(yī)學(xué)界的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。實(shí)體瘤的發(fā)生、生長、轉(zhuǎn)移依賴腫瘤新生血管生成。腫瘤新生血管因受多種血管生長因子的刺激，生長迅速，結(jié)構(gòu)原始，具有管壁薄弱、基底膜不完整、通透性高、缺乏彈力纖維層等先天性發(fā)育缺陷，因此，針對腫瘤新生血管的抗腫瘤血管生成治療是繼化療和放療之后一種新的治療模式，然而，目前已發(fā)現(xiàn)的抗腫瘤血管生成方法，幾乎都是采用化學(xué)或者生物藥物攻擊腫瘤新生血管的特異性生物學(xué)靶點(diǎn)，有一定副作用，

2、治療效果并不理想。針對腫瘤新生血管的物理治療方法未見報道。
　　 近年來，微泡超聲造影劑在基因轉(zhuǎn)染、藥物靶向釋放、溶栓等方面的治療用途越來越受到業(yè)界的關(guān)注。超聲空化效應(yīng)(cavitation，注：空化效應(yīng)是指液體中微氣泡在超聲作用下產(chǎn)生震蕩、膨脹、收縮以及內(nèi)爆等一系列動力學(xué)過程，伴隨瞬態(tài)高溫、高壓、沖擊波、放電和微射流等多種能量釋放行為)是熱效應(yīng)之外另一種超聲的主要物理效應(yīng)。微泡超聲造影劑(簡稱微泡)作為一種有效地空化核，在適當(dāng)

3、超聲脈沖激發(fā)情況下，可以發(fā)生顯著的空化效應(yīng)，空化釋放的機(jī)械能(非熱效應(yīng))具有靶向定位消融組織的潛在能力，這使得破壞病理結(jié)構(gòu)薄弱的腫瘤新生血管成為可能。
　　 本課題在前期執(zhí)行微泡超聲空化阻斷腫瘤血管的研究中發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)靜脈注射脂質(zhì)微泡超聲造影劑聯(lián)合脈沖式超聲照射的情況下，超聲空化損傷效應(yīng)可以被較穩(wěn)定的控制發(fā)生，可以造成正常腸系膜小血管管壁空化機(jī)械損傷，出血、血腫和血栓形成。
　　 目的：
　　 通過經(jīng)靜脈注射微泡可

4、以顯著降低血液超聲空化閾值、增強(qiáng)空化損傷效應(yīng)。本研究建立在微泡聯(lián)合脈沖式超聲阻斷腸系膜微血管實(shí)驗的基礎(chǔ)上，希望通過微泡超聲空化物理破壞、并阻斷兔VX2肝腫瘤新生血管，造成腫瘤微循環(huán)阻斷、缺血壞死和生長抑制，從而探索一種新的、針對腫瘤新生血管的非創(chuàng)傷性物理治療方法。
　　 方法：
　　 (一)主要儀器及試劑：
　　 1.實(shí)驗儀器：課題組自行研制的小型脈沖式聚焦超聲空化治療儀治療頭頻率1.2 MHz，發(fā)射占空比0.5

5、％，峰值負(fù)壓為4.6 MPa，平均聲強(qiáng)(ISPTA)0.89W/cm2。美國通用電器公司Logic9彩色多普勒超聲儀，配有超聲造影模式。
　　 2.實(shí)驗試劑：“脂氟顯”脂質(zhì)微泡第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院自行研制，乳白色凝乳狀微泡懸浮液，核心氣體為全氟丙烷，微泡濃度約為7×109/ml，98％粒徑小于8μm，平均2μm。
　　 (二)微泡增強(qiáng)的超聲空化阻斷正常肝血流灌注的初步研究
　　 1.實(shí)驗分組：將健康新西蘭大白兔3

6、3只分為三組，即超聲微泡組(MB+US組)、單純超聲治療組(US組)、假照組(SHAM組)，超聲微泡組采用超聲照射聯(lián)合經(jīng)靜脈微泡注射；單純超聲組僅有超聲照射；假照組僅施予超聲治療頭假照。其中，每組經(jīng)腹壁照射8只用于造影血流灌注評價，開腹輻照3只用于病理機(jī)制分析。
　　 2.實(shí)驗時間點(diǎn)：各組治療前后超聲造影，分析各時間點(diǎn)為pre(造影前)、0 min、15 min、30 min、45 min、60 min、24h(共7個時間點(diǎn))，

7、記錄其超聲造影灌注峰值灰階變化，對灌注高峰影像進(jìn)行視覺評分，分析微泡增強(qiáng)的超聲空化阻斷兔正常肝實(shí)質(zhì)血流的持續(xù)時間和恢復(fù)情況。
　　 3.超聲空化程序：實(shí)驗兔麻醉后建立耳緣靜脈通道。造影團(tuán)注“脂氟顯，，微泡0.01 ml/kg進(jìn)行超聲造影影像觀察(其中單純超聲治療組及假照組治療前一天造影并存圖)；確定肝臟位置后，按設(shè)定時間和方向治療超聲輻照肝臟。超聲微泡組在治療時，經(jīng)靜脈緩慢推注微泡(0.1 ml/kg，以生理鹽水稀釋至5 ml)

8、同時用超聲治療探頭經(jīng)腹壁輻照肝臟5min；單純超聲治療組用5 ml生理鹽水代替微泡，同時用超聲治療探頭垂直經(jīng)腹輻照5min；假照組用治療頭假照5min，用相同劑量的生理鹽水替代微泡。開腹輻照(用于機(jī)制研究)采用劍下正中線切口，經(jīng)手術(shù)暴露肝臟后輕輕將肝左中葉牽出腹腔用于治療。各組超聲空化治療程序同上完成后立即獲取照射靶區(qū)標(biāo)本用于病理檢查。
　　 4.分析法
　　 (1)視頻密度分析法：記錄各組在治療前后各時間點(diǎn)，靶區(qū)超聲造

9、影動態(tài)影像。以JPG格式輸出各感興趣點(diǎn)的數(shù)字化圖像；然后采用Adobe Photoshop CS3軟件中的直方圖功能對其進(jìn)行灰階定量分析，取樣注意避開大中血管斷面，軟件自動計算出取樣框內(nèi)的平均灰階值。
　　 (2)視覺評分分析法：肝超聲造影血流灌注分析，記錄各組在治療前后各時間點(diǎn)，靶區(qū)肝臟超聲造影動態(tài)影像。局部肝組織血流灌注視覺評分方法分為0-3級，運(yùn)用雙盲法對各時間點(diǎn)造影灌注峰值灰階變化進(jìn)行評分。
　　 (三)微泡增強(qiáng)

10、的超聲空化阻斷VX2腫瘤微血管實(shí)驗
　　 1.實(shí)驗分組及時間點(diǎn)：采用24只VX2腫瘤荷瘤兔，實(shí)驗分組同前，各組腫瘤重復(fù)治療時間點(diǎn)為：0h(開始治療時間)、48h、96h(共3個時間點(diǎn)觀察)。各組觀察時間分別為：pre(治療前)、post(治療后)、30min、24h、48h、96h、10d(共7個時間點(diǎn))。觀察分析各時間點(diǎn)腫瘤造影灌注峰值灰階變化(pre、post、30min、24h)。測量腫瘤體積，實(shí)驗完成后腫瘤標(biāo)本進(jìn)行凋亡檢

11、測。
　　 2.分析法：采用視頻密度法(同4(1))分析腫瘤超聲造影灌注高峰灰階值的變化；按橢球體公式計算腫瘤體積，描繪各組治療后腫瘤生長曲線；病理學(xué)檢查腫瘤壞死情況；TUNEL法檢測各組細(xì)胞凋亡指數(shù)。
　　 結(jié)果：
　　 1.微泡增強(qiáng)的超聲空化阻斷正常肝血流灌注的初步研究
　　 (1)視頻密度：治療前每組各時間點(diǎn)的平均灰度值，ROI區(qū)域的對比平均灰度值范圍是88.4-89.1，三組無顯著統(tǒng)計學(xué)差異。在治

12、療后0min，MB+US組ROI區(qū)域平均灰度值顯著降低至2.7±2.7，而后在24小時逐漸恢復(fù)至92.8士13.9。平均灰度值基線顯著高于治療后的0min，15min和30min時間點(diǎn)，但與45min，60min和24h結(jié)果相比無顯著差異。而US組和Sham組所有時間點(diǎn)的平均灰度值變化在88.2-89.7內(nèi)，無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。實(shí)驗組(MB+US)的造影高峰的平均灰度值變化略呈“U”形，即在治療后幾乎陡降為0，而后逐漸上升直至

13、恢復(fù)正常的造影前水平。
　　 (2)視覺評分：各組治療前肝臟血流灌注視覺評分均為0，沒有任何差異；Kruskal-wallis檢驗顯示，MB+US、US、SHAM組的統(tǒng)計量分別為37.34、1.26、0，即MB+US組各時間點(diǎn)視覺評分差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，US、SHAM組各時間點(diǎn)視覺評分差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義。兩兩比較的Nemenyi檢驗結(jié)果顯示，MB+US組pre時的評分顯著優(yōu)于post、15min的評分，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0

14、.05)；post與pre、45min、60min、24h評分差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；15min與pre、60min、24h評分差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；30min與各時間點(diǎn)均無差異(P＞0.05)；45min與post評分差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；60min和24都與post、15min的評分差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 病理學(xué)檢查：假照組肝組織未見異常；單純超聲組：偶見肝組織局灶性小片狀充血、出血

15、；超聲微泡組：大片肝組織出血、肝竇充血、血管壁斷裂、內(nèi)皮細(xì)胞條狀脫落及血栓形成，中央靜脈周圍肝細(xì)胞水腫、變性。
　　 2.超聲空化阻斷腫瘤微循環(huán)實(shí)驗結(jié)果
　　 各組治療前超聲造影示腫瘤血供豐富，呈高灌注相，少數(shù)較大腫瘤內(nèi)部可見片狀充盈缺損。各組腫瘤造影峰值GSV(變化在93.36-96.4)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。假照組、單純超聲組治療后即刻及治療后30min、24h腫瘤仍呈高灌注相，腫瘤組織造影圖像灰階

16、值與治療前對比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 超聲微泡組治療后即刻超聲造影，腫瘤及周邊肝組織幾乎無造影劑灌注，造影灰階值顯著降低至13.87±10.04(P＜0.05)，治療后30 min時間點(diǎn)造影可見腫瘤內(nèi)灌注有部分恢復(fù)，但平均灰階值66.09±21.85仍然顯著低于治療前(P＜0.05)，治療后24h腫瘤恢復(fù)高灌注相(P＞0.05)，與治療前比較無顯著差異(P＞0.05)。
　　 腫瘤體積及凋亡：治療前各

17、組腫瘤體積(0.37-0.45cm3)無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，治療后第10d，治療組、單純超聲組及假照組的腫瘤平均體積分別為1.53cm3、2.27 cm3、2.46 cm3，治療組顯著小于對照組(P＜0.05)。通過TUNEL法檢測，微泡超聲組治療后10d凋亡指數(shù)明顯升高，而單純超聲及假照組凋亡指數(shù)相對較低。
　　 結(jié)論：
　　 微泡聯(lián)合脈沖式超聲空化治療儀產(chǎn)生的空化效應(yīng)可暫時阻斷正常肝臟的微循環(huán)，并在1小時以內(nèi)