貴州省畜禽主要病原菌耐藥性及耐藥基因研究.pdf

1、隨著我國(guó)畜禽集約化養(yǎng)殖的不斷發(fā)展，畜禽病原菌的耐藥性問(wèn)題日益突出。由于抗菌藥物的不合理使用，使得耐藥菌株不斷涌現(xiàn)，多重耐藥現(xiàn)象不斷惡化，耐藥機(jī)制愈加復(fù)雜，這給畜禽細(xì)菌病臨床治療帶來(lái)了很大的困難，嚴(yán)重威脅著公共衛(wèi)生安全，也給新藥開(kāi)發(fā)帶來(lái)了巨大的壓力。貴州省有關(guān)畜禽細(xì)菌耐藥性系統(tǒng)研究鮮有報(bào)道，本研究擬在分析研究資料和調(diào)查報(bào)告的基礎(chǔ)上，開(kāi)展貴州省畜禽主要病原細(xì)菌的快速檢測(cè)技術(shù)、耐藥表型和基因型、耐藥基因序列進(jìn)化特征等相關(guān)研究，對(duì)深入探討細(xì)菌耐

2、藥性分子機(jī)制具有理論意義。
　　1.貴州省畜禽源主要病原細(xì)菌流行病學(xué)研究：通過(guò)對(duì)貴州省2008~2014年間研究資料、調(diào)查報(bào)告進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，分別從時(shí)間分布、動(dòng)物類(lèi)別分布、地域分布等方面對(duì)畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)細(xì)菌性疫病流行特點(diǎn)進(jìn)行分析，并對(duì)畜禽細(xì)菌病臨床病例的防控情況進(jìn)行調(diào)查分析。結(jié)果顯示：此間貴州省畜禽細(xì)菌性疫病主要以大腸埃希氏菌病、葡萄球菌病、鏈球菌病、巴氏桿菌病和沙門(mén)氏菌病為主；發(fā)病呈一定的季節(jié)性，每年5~9月為高發(fā)期，10~12月為低

3、發(fā)期，細(xì)菌性疫病發(fā)生主要以羊?yàn)橹鳎溆嘁来问秦i、牛、禽等；各地細(xì)菌病發(fā)病例數(shù)存在一定差異，其中銅仁市各種主要細(xì)菌性疫病的病例數(shù)高于其他地區(qū)，細(xì)菌性疫病免疫防控率較低，免疫率在2.3％~20.6%之間，主要防控方式依然是抗菌藥防控。養(yǎng)殖場(chǎng)最常用的抗菌藥物有β-內(nèi)酰胺類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)、磺胺類(lèi)、大環(huán)內(nèi)脂類(lèi)和喹諾酮類(lèi)抗菌藥物，其中β-內(nèi)酰胺類(lèi)使用最為頻繁。
　　2.畜禽主要病原菌多重PCR方法的建立與應(yīng)用：針對(duì)貴州省主要流行病原菌（大腸埃希

4、氏菌、沙門(mén)氏菌、巴氏桿菌、鏈球菌、葡萄球菌實(shí)驗(yàn)室前期分離，進(jìn)行過(guò)相關(guān)致病性研究）設(shè)計(jì)合成引物，構(gòu)建PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，并評(píng)估多重PCR方法的性能，對(duì)研究所需的分離菌株進(jìn)行復(fù)檢分析。結(jié)果顯示：所設(shè)計(jì)的各種細(xì)菌PCR引物均能有效擴(kuò)增目的基因，其中擴(kuò)增出的大腸埃希菌23S rRNA基因、巴氏桿菌KMT基因、沙門(mén)氏菌invA基因、葡萄球菌的nuc基因和鏈球菌的EF-TU基因片段大小分別為663 bp、456 bp、284 bp、500 b

5、p和197 bp。構(gòu)建能同時(shí)檢測(cè)葡萄球菌和鏈球菌的雙重PCR最佳反應(yīng)條件為：葡萄球菌和鏈球菌的引物濃度分別為0.5μmol/L和0.5μmol/L，退火溫度為54℃；在此條件下同時(shí)檢測(cè)葡萄球菌和鏈球菌的敏感性分別是1.50 ng/μL和1.44 ng/μL。構(gòu)建能同時(shí)檢測(cè)大腸埃希氏菌、沙門(mén)氏菌和巴氏桿菌的三重PCR最佳反應(yīng)條件為：大腸埃希氏菌、巴氏桿菌和沙門(mén)氏菌的引物濃度分別為1.0μmol/L、1.5μmol/L和1.0μmol/L，

6、退火溫度為56℃；在此條件下同時(shí)檢測(cè)大腸埃希氏菌、巴氏桿菌和沙門(mén)氏菌的敏感性分別是114.00 pg/μL、1.50 ng/μL和1.44 ng/μL。對(duì)147株臨床分離菌株的檢測(cè)顯示，雙重PCR和三重PCR檢測(cè)結(jié)果與生化鑒定結(jié)果的符合率分別為97.26%和98.72%，結(jié)果表明所建立的PCR方法檢測(cè)結(jié)果跟傳統(tǒng)生化鑒定結(jié)果高度一致。
　　3.畜禽主要病原細(xì)菌耐藥表型和耐藥基因型研究：隨機(jī)選取畜禽5種病原菌共151株，應(yīng)用K-B法對(duì)

7、5類(lèi)21種抗菌藥對(duì)其進(jìn)行藥物敏感性實(shí)驗(yàn)，并針對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)耐藥基因、喹諾酮類(lèi)耐藥基因、大環(huán)內(nèi)脂類(lèi)耐藥基因、鏈霉素耐藥基因和磺胺類(lèi)耐藥基因設(shè)計(jì)合成了23對(duì)特異性引物，檢測(cè)各種細(xì)菌耐藥相關(guān)基因，分析細(xì)菌耐藥表型和耐藥基因型相關(guān)性。結(jié)果顯示：所有供試菌株均表現(xiàn)出明顯的耐藥性，總耐藥率在54.42%~93.20%之間，多重耐藥主要集中耐6-11種藥物之間。在選取的21種抗生素中，以青霉素、阿莫西林、鏈霉素和磺胺甲基異惡唑的抑菌效果較差；23個(gè)耐

8、藥基因共檢出19個(gè)，檢出率最高的是大腸埃希氏菌喹諾酮類(lèi)aac(6’)-Ib-cr，為77.59%。介導(dǎo)我省大腸埃希氏菌對(duì)磺胺類(lèi)藥物產(chǎn)生耐藥性的耐藥基因主要是sul1、對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物產(chǎn)生耐藥性的耐藥基因主要是aac(6’)-Ib-cr，對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物產(chǎn)生耐藥性的耐藥基因主要是TEM；介導(dǎo)我省巴氏桿菌對(duì)磺胺類(lèi)藥物產(chǎn)生耐藥性的耐藥基因主要是sul2、對(duì)鏈霉素產(chǎn)生耐藥性的耐藥基因主要是StrA；介導(dǎo)我省沙門(mén)氏菌對(duì)磺胺類(lèi)藥物產(chǎn)生耐藥性的耐藥基

9、因主要是sul2、對(duì)鏈霉素產(chǎn)生耐藥性的耐藥基因主要是StrA；介導(dǎo)我省葡萄球菌對(duì)大環(huán)類(lèi)脂類(lèi)藥物產(chǎn)生耐藥性的耐藥基因主要是ermB，對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物產(chǎn)生耐藥性的耐藥基因主要是blaZ；介導(dǎo)我省鏈球菌對(duì)大環(huán)類(lèi)脂類(lèi)藥物產(chǎn)生耐藥性的耐藥基因主要是ermB；通過(guò)對(duì)151株臨床分離株耐藥表型和耐藥基因相關(guān)性分析，結(jié)果顯示：細(xì)菌對(duì)鏈霉素耐藥的耐藥基因跟耐藥表型的符合率最高，為100%，巴氏桿菌對(duì)磺胺類(lèi)藥物的耐藥表型與耐藥基因型的符合率最低，為71.

10、43%。
　　4.畜禽主要病原細(xì)菌耐藥相關(guān)基因序列分析：應(yīng)用分子克隆技術(shù)對(duì)各種細(xì)菌主要耐藥基因進(jìn)行克隆及測(cè)序，應(yīng)用MegAlign軟件對(duì)測(cè)序序列進(jìn)行同源性、基因一致性和遺傳進(jìn)化分析。結(jié)果顯示：除大腸埃希氏菌aac(6’)-Ib-cr基因、巴氏桿菌gyrA和parC基因、鏈球菌gyrA和parC基因存在較多變異外，其他耐藥基因均表現(xiàn)出較高的保守性，其中最保守的是大腸桿菌CTX-M基因、巴氏桿菌sul2基因和鏈球菌mefA基因，與國(guó)內(nèi)

11、外參考菌株的序列同源性均為100%。
　　結(jié)論：
　　1.貴州省畜禽細(xì)菌病主要病原菌為大腸埃希氏菌、巴氏桿菌、沙門(mén)氏菌、葡萄球菌和鏈球菌；細(xì)菌病發(fā)生存在時(shí)間和地域差異。
　　2.建立可快速鑒定大腸埃希氏菌、沙門(mén)氏菌、巴氏桿菌的三重PCR方法和葡萄球菌、鏈球菌的雙重PCR方法，二者對(duì)臨床分離株的檢測(cè)結(jié)果與生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果符合率高。
　　3.貴州省畜禽五種主要病原細(xì)菌存在廣泛耐藥，耐藥基因種類(lèi)多樣，耐藥表型和耐藥基因