葡萄科藥用植物三葉崖爬藤的親緣地理學(xué)和分子鑒定研究.pdf

1、三葉崖爬藤（Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg）隸屬于葡萄科(Vitaceae)崖爬藤屬（Tetrastigma Planch.），是中國特有的民間藥用植物，俗稱“三葉青”。該物種廣泛分布于中國大陸的亞熱帶地區(qū)，在南部熱帶和亞熱帶島嶼（海南島、臺灣）也有少量分布，是中國亞熱帶常綠闊葉林下的典型廣布成分。常綠闊葉林為中國亞熱帶低海拔地區(qū)的典型植被類型，它起源古老，自晚第三紀(jì)以來經(jīng)歷了復(fù)雜的植被變遷歷

2、史。古植被重建研究認(rèn)為這一植被類型在末次盛冰期時完全退居至南部熱帶地區(qū)，全新世氣溫回暖后從南部避難所向北回遷;而有限的親緣地理學(xué)研究案例則一致揭示了物種在冰期原地居留在多個避難所，冰后期僅存在有限的擴張。因此，中國亞熱帶常綠闊葉林及其組成物種對歷史氣候變化的響應(yīng)模式目前仍不甚清楚，亟需選擇該森林植被的典型的廣布成分，并整合多學(xué)科的研究手段進行深入研究。本研究以常綠闊葉林下的重要藤本類型三葉崖爬藤為研究對象，在廣泛的野外資源調(diào)查和取樣的基

3、礎(chǔ)上，結(jié)合親緣地理、系統(tǒng)發(fā)育、生物地理以及生態(tài)位模型的理論和方法，系統(tǒng)探討了第三紀(jì)以來中國亞熱帶常綠闊葉林物種在不同時空尺度下的譜系分化、群體動態(tài)歷史和遺傳變異的空間分布格局，并利用分子鑒定技術(shù)開發(fā)了物種特異性SCAR分子標(biāo)記，為三葉崖爬藤藥材的科學(xué)鑒定提供技術(shù)支持。本研究獲得的主要研究結(jié)果如下:
　　(1)基于葉綠體序列的種內(nèi)譜系分化和群體動態(tài)歷史
　　基于三個cpDNA片段（petL-psbE，trnK-matK，rbc

4、L），對三葉崖爬藤的20個群體進行序列變異分析，共檢測到20個葉綠體單倍型。在物種水平，三葉崖爬藤具有較高的葉綠體遺傳多樣性（hT=0.918;πT=2.110×10-3）和顯著的譜系地理結(jié)構(gòu)(NST=0.851，GST=0.795，P＜0.05)。系統(tǒng)發(fā)育分析和TCS構(gòu)建的單倍型譜系關(guān)系均支持三葉崖爬藤種內(nèi)存在兩大地理譜系:西南譜系(SW)譜系和中東部譜系(CSE)。CSE譜系可進一步劃分為海南島、中國中部和東南部三大分支。對上述四個

5、地理分支（中國西南，中部，東南部，海南）進行分層次的AMOVA分析揭示:67.9％的變異存在于地區(qū)間，19.5％存在于地區(qū)內(nèi)群體間?；赾pDNA序列和多化石點校正的BEAST分歧時間估算結(jié)果表明，SW譜系和CSE譜系在上新世早期(c.5.07 Ma)開始分化。CSE譜系內(nèi)部三個主要分支的分化時間均在上新世晚期，其中，海南島分支最早分化(c.2.78 Ma)，中國中部和東南部兩大分支的分化時間較晚(c.2.12 Ma)?；谌~綠體數(shù)據(jù)的

6、祖先分布區(qū)重建結(jié)果揭示了，上新世早期的全球變冷和地質(zhì)變化引發(fā)的地理隔離事件導(dǎo)致了三葉崖爬藤祖先群體壓縮到中國西南部和南部兩個避難所，進而分化形成兩個獨立的地理譜系，西南地區(qū)群體長期居留原地，而中國南部群體在上新世晚期到更新世早期經(jīng)歷了兩次獨立的由南向北的拓殖事件。失配分析結(jié)果也證實了SW譜系具有相對穩(wěn)定的群體歷史，僅在CSE譜系及其中部分支檢測到了群體擴張信號，擴張事件發(fā)生在更新世早期到中期(CSE.0.81 Ma;中部分支:0.71

7、Ma)。上述研究結(jié)果揭示了第四紀(jì)前的東亞的環(huán)境變化對亞熱帶常綠闊葉林物種遺傳結(jié)構(gòu)的長期影響。
　　(2)微衛(wèi)星水平的群體遺傳結(jié)構(gòu)和地區(qū)間基因流
　　本研究基于雙重抑制法發(fā)開了8對有多態(tài)性的三葉崖爬藤特異性微衛(wèi)星引物?；谖⑿l(wèi)星數(shù)據(jù)的STRUCTURE聚類分析結(jié)果表明，三葉崖爬藤群體可以劃分為四個地理分組，分別對應(yīng)于中國西南部、中部、東部和南部地區(qū)（包括海南），這一模式反映了更新世后期該物種被壓縮到至少四個獨立的避難所?；贛

8、IGRATE的地區(qū)間基因流檢測結(jié)果表明，葉綠體地理分支（西南部、中部、海南、東南部群體）間存在中等或較低水平的基因流;個別地區(qū)間，如海南和東南部大陸群體間，存在明顯的不對稱基因流。生態(tài)位模型的模擬結(jié)果顯示，末次盛冰期時三葉崖爬藤的適宜分布區(qū)向西南方向有一定的遷移，但是并沒有完全退縮到南部熱帶地區(qū)，南部大陸地區(qū)保留了穩(wěn)定的適宜生境并進一步擴展到南海大陸架區(qū)域，因此更新世冰期路橋的形成很可能為海南島和大陸群體間的二次接觸提供了遷移通道。這些

9、研究結(jié)果反映了物種在末次冰期-間冰期循環(huán)中相對穩(wěn)定的群體歷史，對前期古植被重建提出的“中國亞熱帶常綠闊葉林在末次盛冰期完全退居至中國南部熱帶地區(qū)”的觀點提出了挑戰(zhàn)。
　　(3)比較轉(zhuǎn)錄組和單拷貝核基因開發(fā)
　　通過Hiseq2000測序平臺對三葉崖爬藤CSE譜系和SW譜系個體進行轉(zhuǎn)錄組測序，運用de novo從頭組裝的方法，分別獲得了52，838和65，197條unigenes，其中89％以上的unigene可以比對到公共蛋

10、白庫中?；谛蛄邢嗨菩裕覀児舱页?692對譜系間直系同源基因，其中有10對基因的Ka/Ks值顯著大于0.5，可能經(jīng)歷了較強的正向選擇或松散的凈化選擇，有3734對基因的Ka/Ks比值顯著小于0.5，表明受到了強烈的凈化選擇作用。從譜系間的直系同源基因中我們共定位了286個EST-SSR位點，有78個位點在譜系間可能存在長度多態(tài)性。基于三種生物信息學(xué)手段，我們共鑒定了1018個單拷貝核基因位點，約78％的位點在譜系間存在中等或高水平的遺

11、傳分化(Pairwise identity≤99.5％)。通過與葡萄基因組比對預(yù)測內(nèi)含子-外顯子邊界，本研究成功開發(fā)了12對外顯子錨定的核基因引物，其中8對在葉綠體單倍型個體間具有較高的多態(tài)性（hT:0.909-0.993;πT:7.32-16.01×10-3），為后續(xù)基于多位點的統(tǒng)計親緣地理學(xué)和景觀遺傳學(xué)研究提供了有效的功能基因標(biāo)記。
　　(4)三葉崖爬藤（三葉青）的分子鑒定
　　本研究從100對ISSR通用引物中篩選了1