SLE患者T細胞增殖中Akt-GSK3β信號通路的異常及其在骨髓間充質(zhì)干細胞干預(yù)中的變化.pdf

1、研究背景:SLE是一種典型的自身免疫性疾病，存在多種免疫異常，包括T、B淋巴細胞的異?；罨鲋?，自身反應(yīng)性抗體的大量產(chǎn)生，免疫復(fù)合物的形成及沉積，造成組織器官，特別是腎實質(zhì)的免疫損傷，引起腎小球腎炎，甚至腎功能衰竭。
　　 學(xué)者們普遍認(rèn)為人和小鼠狼瘡發(fā)病過程中T細胞異常活化增殖起關(guān)鍵作用，抑制T細胞的活化和增殖對SLE治療有重要意義。Akt/GSK3β途徑是影響細胞增殖活化的一條重要通路，Akt在T淋巴細胞活化增殖過程中作為增殖

2、及生存信號的重要介質(zhì)，其磷酸化可調(diào)控細胞周期進程促進T細胞增殖。越來越多的證據(jù)顯示Akt的異常磷酸化可通過促進細胞增殖參與疾病的發(fā)生發(fā)展，研究表明SLE小鼠T細胞中Akt的磷酸化水平增高。磷酸化的Akt主要通過對含有絲氨酸/蘇氨酸殘基的底物磷酸化而發(fā)揮作用，目前，已確認(rèn)的Akt下游底物包括GSK3β、p21WAFI/CIPI、mTOR等，其中，GSK3β是Akt的重要底物之一，缺乏生長因子等刺激時GSK3B可使p27kipl磷酸化，增強

3、其穩(wěn)定性，阻止細胞周期進程。與Akt相反，靜息細胞中GSK3p處于活化狀態(tài)，細胞活化時其磷酸化而失活，文獻報道T細胞活化早期GSK3β迅速滅活，通過誘導(dǎo)NFAT(活化T細胞核因子)活化和IL-2產(chǎn)生調(diào)節(jié)TCR介導(dǎo)的T細胞增殖。盡管既往研究證實調(diào)節(jié).Akt上游分子P13K活性可改善SLE病情，而且提示P13K/Akt信號通路的改變可能對SLE發(fā)病有影響，但關(guān)于人類SLE患者Akt在T細胞增殖中的表達，特別是Akt的表達與狼瘡腎炎的關(guān)系國內(nèi)

4、外相關(guān)報道較少，且其對下游蛋白分子GSK3β的影響仍不清楚，需要進一步證實這一途徑在人類SLE發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　 目前由于發(fā)病機制未明，SLE尚缺乏理想的治療方法，尋求相對創(chuàng)傷小、簡便、安全、易于臨床應(yīng)用的治療方法已成為目前國內(nèi)外研究的熱點。
　　 骨髓間充質(zhì)干細胞(BM-MSC)是骨髓中除了造血干細胞以外的另一類干細胞，具有誘導(dǎo)免疫耐受和免疫抑制、促進免疫重建的作用。通?？乖碳た梢餞細胞分裂，BM-MSC可通

5、過抑制細胞分裂而使細胞積聚在G1期。體外研究發(fā)現(xiàn)MSC能抑制包括同種異體抗原和絲裂原引起的T細胞增殖。
　　 本實驗首先觀察了SLE患者T細胞增殖中.Akt/GSK3β通路的活化狀態(tài)，并在此基礎(chǔ)上探討SLE患者T細胞增殖時Akt/GSK3β信號通路在骨髓間充質(zhì)干細胞干預(yù)中的變化。
　　 第一部分SLE患者T細胞增殖中Akt/GSK313信號通路的異常表達
　　 目的:通過觀察SLE患者特別是狼瘡腎炎患者T細胞增殖

6、過程中Akt/GSK3β信號通路的表達情況，了解Akt/GSK3β信號通路在SLE患者T細胞異常增殖過程中所起的作用。
　　 方法:
　　 1、研究對象:實驗中SLE患者均符合1997年修訂的美國風(fēng)濕學(xué)會SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)，疾病活動評分標(biāo)準(zhǔn)采SLEDAI。根據(jù)是否有腎損害分為腎損害組(RSLE組)和非腎損害組(SLE組)。選擇性別、年齡與患者組相匹配的健康志愿者作為對照。
　　 2、外周血單個核細胞(主要是T細胞)的

7、分離和培養(yǎng):采用人Ficoll-Hypaque淋巴細胞分離液的密度梯度離心法分離外周血單個核細胞(PBMC，大部分是T細胞)，用植物血凝素(PHA)刺激。
　　 3、流式細胞儀檢測細胞周期。
　　 4、用western blot檢測細胞蛋白表達。
　　 5、MTT法檢測細胞活性。
　　 結(jié)果:
　　 1、患者淋巴細胞在不同細胞周期的分布：未用PHA刺激時腎損害組和非腎損害組患者淋巴細胞在不同細胞周

8、期時相的分布與對照組相比無明顯差異，用PHA刺激48小時后，腎損害組和非腎損害組患者淋巴細胞S期比例與對照組相比顯著增高，而刺激后兩組患者淋巴細胞G0/G1比例與對照組相比顯著降低，以腎損害組最明顯，G2/M比例三組淋巴細胞之間無差異。
　　 2、患者T細胞增殖中CDK2、p21WAF1/CIP1和p27kiP1的表達：靜息狀態(tài)下，腎損害組和非腎損害組淋巴細胞中CDK2僅輕度表達，PHA刺激后，三組淋巴細胞CDK2表達均增強，且

9、在腎損害組改變最顯著；相反，在腎損害組和非腎損害組未刺激淋巴細胞與對照組相比p27kiPl和p21WAF1/CIP1表達輕度降低，PHA刺激后三組淋巴細胞p27kip1和p21WAF1/CIP1表達均進一步下調(diào)，腎損害組改變最明顯。
　　 3、患者T細胞增殖中Akt及GSK3β磷酸化水平：與對照組相比，腎損害和非腎損害組未刺激淋巴細胞Akt和GSK3β的磷酸化水平輕度增高，PHA刺激可增高各組淋巴細胞Akt和GSK3β的磷酸化水

10、平，腎損害組表現(xiàn)最明顯，但各組刺激前后總Akt和GSK3β水平無明顯改變。
　　 4、GSK3β抑制劑對患者淋巴細胞增殖的影響：GSK3β抑制劑氯化鋰或SB216763處理淋巴細胞后，腎損害組淋巴細胞增殖程度分別增加51.5％和42.6％，而非腎損害組則分別增加33.5％和30.3％，對照組淋巴細胞用氯化鋰或SB216763刺激后其增殖程度分別增加24.2％和20.5％，腎損害組淋巴細胞增加最顯著。
　　 結(jié)論:

11、　　 1、SLE患者T細胞增殖過程中Akt、GSK3p磷酸化水平明顯增高，說明Akt/GSK3B信號通路存在異常。
　　 2、SLE患者T細胞增殖過程中細胞周期調(diào)控蛋白表達改變從而影響細胞周期進程。
　　 第二部分SLE患者T細胞增殖中Akt/GSK3β信號通路在骨髓間充質(zhì)干細胞干預(yù)中的變化
　　 目的:通過觀察BM-MSC對SLE患者T細胞增殖的影響及SLE患者T細胞增殖過程中AkVGSK3β信號通路在BM-

12、MSC干預(yù)時的變化，探討AkVGSK3β調(diào)控通路在BM-MSC抑制SLE患者T細胞增殖中的作用。
　　 方法:
　　 1、骨髓間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定：采用羥基淀粉沉淀聯(lián)合Ficoll密度梯度離心法分離骨髓單個核細胞，貼壁法進行原代細胞培養(yǎng)，胰酶消化法傳代接種培養(yǎng)，流式細胞術(shù)檢測BM-MSC表面標(biāo)志表達。
　　 2、按說明書用自動化磁性細胞分選儀分選CD3+T淋巴細胞
　　 3、體外BM-MSC對T

13、細胞增殖的影響
　　 按以下分組:(1)陰性對照組:單獨淋巴細胞培養(yǎng)組；(2)陽性對照組:淋巴細胞加PHA培養(yǎng)組；(3)實驗組:淋巴細胞加PHA及BM-MSC細胞培養(yǎng)，MTT法檢測BM-MSC作用后淋巴細胞的相對活細胞數(shù)(吸光度A值)及計算細胞存活率。
　　 4、研究對象、外周血單個核細胞的分離和培養(yǎng)、蛋白表達的檢測同前。
　　 結(jié)果:
　　 1、BM-MSC對正常人T細胞增殖的影響：BM-MSC作用于P

14、HA刺激的正常人CD3+T細胞，發(fā)現(xiàn)其吸光度與單純PHA刺激組相比明顯降低，T細胞增殖被明顯抑制(與PHA刺激組比較，細胞增殖下降55.55％)。
　　 2、BM-MSC對正常人T細胞CDK2、p21TMF1/CIP1和p27kip1表達的影響：BM-MSC加PHA刺激組CDK2表達被抑制，p21TMF1/CIP1和p27kip1明顯上調(diào)，而單純PHA刺激組T細胞CDK2表達增加，p21TMF1/CIP1、p27kip1下調(diào)。<

15、br>　　 3、BM-MSC對正常人T細胞Akt及6SKap磷酸化水平的影響：PHA刺激后Akt磷酸化水平顯著上升，加入BM+MSC則使PHA刺激上升的Akt磷酸化水平下降；PHA束U激后GSK313磷酸化水平明顯增高，GSK313失活，加入BM-MSC后較PHA刺激組GSK3β磷酸化水平下降，但各組刺激前后總Akt和GSK3β水平無明顯改變。
　　 4、正常人BM-MSC對SLE患者T細胞增殖的影響：BM-MSC加入PHA刺

16、激的SLE患者PBMC細胞，發(fā)現(xiàn)其吸光度明顯低于PHA刺激組，T細胞增殖被抑制(與PHA束U激組比較，細胞增殖下降57.23％)。
　　 5、BM-MSC對SLE，患者T細胞CDK2、p27kip1和p21WAF1CIP1表達的影響：PHA刺激后，患者淋巴細胞CDK2表達較強而p21WAF1CIP1、p27kip1則明顯減低，加入BM-MSC干預(yù)則抑制CDK2的表達而強烈表達p21WAF1CIP1和p27kip1。
　　

17、 6、BM-MSC對SLE患者T細胞Akt及GSK3β磷酸化水平的影響：PHA刺激SLE患者PBMC后Akt磷酸化水平上升，而BM-MSC干預(yù)則引起Akt磷酸化水平下降；PHA刺激使細胞GSK3β磷酸化水平明顯增高，與BM-MSC共培養(yǎng)則其磷酸化水平較PHA刺激組下降，但各組刺激前后總Akt和GSK3β水平無明顯改變。
　　 結(jié)論:
　　 1、 BM-MSC干預(yù)SLE患者T細胞增殖，使其Akt、GSK3β磷酸化水平降低，