新型核苷類(lèi)化合物β-L-D4A抗乙型肝炎病毒作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分: 目的: 本文研究的β-L-D4A是一種新型核苷類(lèi)化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)不同于3TC，其堿基不是C(胞嘧啶)，而是A(腺嘌呤)，戊糖環(huán)呈不飽和雙鍵結(jié)構(gòu)。在研究中，采用乙型肝炎病毒基因轉(zhuǎn)染的人肝癌細(xì)胞系2.2.1細(xì)胞作為細(xì)胞模型，研究β-L-D4A對(duì)2.2.15細(xì)胞HBV的抑制作用及細(xì)胞毒性研究，初步探討β-L-D4A體外抗HBV作用。 方法: 2.2.15細(xì)胞用胰酶消化液消化,以濃度1×105/well接種于24孔

2、培養(yǎng)板,每孔110μl,加DMEM培養(yǎng)液1.5ml，于5％CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)48時(shí)后,細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好。三組分別換含不同藥物濃度的培養(yǎng)液,陽(yáng)性對(duì)照組加含3TC的培養(yǎng)液，空白對(duì)照每孔加1.5ml含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。 本實(shí)驗(yàn)室既往研究顯示：2.2.15細(xì)胞接種后第1天在培養(yǎng)液上清中即可檢測(cè)到抗原分泌，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，病毒抗原分泌量逐漸增加，到接種后第7～8天達(dá)到高峰，此后抗原分泌逐漸穩(wěn)定。 結(jié)果：（略）

3、 結(jié)論: 2.2.15細(xì)胞是用含有2個(gè)頭尾相連HBV DNA全基因的表達(dá)質(zhì)粒和帶有耐新霉素基因的載體共轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞株HepG2而建立的，該細(xì)胞株能長(zhǎng)期穩(wěn)定地向培養(yǎng)上清液中分泌病毒蛋白和完整的病毒顆粒，而且還能產(chǎn)生大量的病毒復(fù)制中間體，是體外篩選抗HBV藥物較好的細(xì)胞模型。正如已有研究所證實(shí)的，2.2.15細(xì)胞穩(wěn)定分泌HBsAg、HBeAg并具備一定的規(guī)律性，本實(shí)驗(yàn)中也觀察到的，2.2.15細(xì)胞在接種24孔板次日即可檢測(cè)到HBs

4、Ag、HBeAg的分泌，隨著接種時(shí)間延長(zhǎng)，抗原分泌逐漸增加，到接種后7-8天抗原分泌達(dá)高峰，以后呈現(xiàn)平臺(tái)現(xiàn)象。正是這種穩(wěn)定性是短暫表達(dá)細(xì)胞系和共轉(zhuǎn)染體系所無(wú)法比擬的，而且2.2.15細(xì)胞內(nèi)存在整合型HBVDNA，可長(zhǎng)期產(chǎn)生HBV及其抗原，排泌功能可保持12月之久，因而可以完整再現(xiàn)HBV的復(fù)制和表達(dá)，在進(jìn)行抗HBV治療研究中，可以進(jìn)一步探討治療機(jī)理，通過(guò)Southern blot斑點(diǎn)雜交，Northern blot，ELISA，Weste

5、rn blot等方法可以判斷藥物是在復(fù)制、轉(zhuǎn)錄或表達(dá)的哪一個(gè)環(huán)節(jié)上產(chǎn)生抗病毒活性的，從而為進(jìn)一步研究HBV生物學(xué)特性、致病機(jī)制以及乙型肝炎的預(yù)防、診斷及治療等奠定基礎(chǔ)。本課題采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)HBV DNA含量的變化，說(shuō)明β-L-D4A的抗HBV活性。 在本研究中發(fā)現(xiàn)，β-L-D4A以濃度依賴(lài)性的方法抑制HBVDNA復(fù)制，與3TC作用類(lèi)似。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果依Reed Muench方法計(jì)算IC50，β-LD4A和3TC

6、的IC50值分別是0.61uM、0.30uM。Β-L-D4A對(duì)HBsAg表達(dá)的抑制效應(yīng)不如對(duì)HBV DNA復(fù)制的抑制效應(yīng)明顯。當(dāng)β-L-D4A在最高濃度100umol/L時(shí),對(duì)HBsAg 表達(dá)抑制效率略高于50％。當(dāng)藥物濃度低于125uM，β-L-D4A和3TC的細(xì)胞毒性都不明顯。當(dāng)藥物濃度在1000uM時(shí)，細(xì)胞存活率低于50％。根據(jù)ReedMuench方法計(jì)算兩種藥物的TD50值，β-L-D4A和3TC分別為417uM和243uM。實(shí)

7、驗(yàn)結(jié)果顯示其為高效低毒的抗HBV藥物。Β-L-D4A是一中新型的L構(gòu)型的核苷類(lèi)似物，為dATP的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物。Β-L-2',3'－雙脫氧－3'－硫胞嘧啶核苷即拉米夫定，是具有代表性的一類(lèi)L構(gòu)型的核苷類(lèi)化合物，研究發(fā)現(xiàn)抗病毒的效應(yīng)是其D構(gòu)型的對(duì)映異構(gòu)體的50倍。推測(cè)β-L-D4A象其他的核苷類(lèi)抗病毒藥物一樣，通過(guò)抑制HBV聚合酶功能來(lái)抑制HBV基因組的復(fù)制。為了證實(shí)這個(gè)推測(cè)需要進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。也需要進(jìn)行進(jìn)一步的研究來(lái)確定β-L-D4A是否

8、對(duì)有拉米夫定抗性的病毒株有抑制效應(yīng)，及這個(gè)化合物本身能否誘導(dǎo)HBV 耐藥株或突變株的出現(xiàn)。 除此之外，還需要進(jìn)行這個(gè)化合物的代謝、毒性和藥代動(dòng)力學(xué)方面的研究。本實(shí)驗(yàn)對(duì)β-L-D4A進(jìn)行了初步的研究，證實(shí)β-L-D4A在體外具有抗HBV的效應(yīng)，為將來(lái)的臨床應(yīng)用打下了基礎(chǔ)。 第二部分: 目的：一些抗HBV的藥物已經(jīng)應(yīng)用于臨床，包括干擾素和核苷類(lèi)藥物如拉米夫定。當(dāng)前抗HBV 藥物開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)集中于核苷類(lèi)HBV 聚合酶抑制

9、劑的研究。HBV 聚合酶有RNA 依賴(lài)的逆轉(zhuǎn)錄、DNA 依賴(lài)的DNA 聚合和RNase H的功能，這種多功能的酶是核苷類(lèi)抗病毒藥物的作用靶點(diǎn)。beta-L-2',3'-雙脫氫-2',3'-雙脫氧呋喃腺嘌呤核苷（β-L-D4A）是天然的脫氧腺嘌呤核苷的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，不同之處有兩點(diǎn)，其一他們構(gòu)型不同，天然的脫氧腺嘌呤核苷為D 構(gòu)型，第二個(gè)不同之處在于在β-L-D4A的戊糖環(huán)中，2'和3'碳原子間為雙鍵，且3'碳原子上沒(méi)有羥基。之前的研究表明在

10、2.2.15細(xì)胞中，β-L-D4A 能抑制HBV基因組的復(fù)制，降低細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBsAg的含量。在轉(zhuǎn)基因小鼠實(shí)驗(yàn)中，β-L-D4A 能快速降低血清中HBV DNA和HBsAg 含量，且沒(méi)有明顯的藥物誘導(dǎo)的肝臟和腎臟毒性。推測(cè)象其他的核苷類(lèi)抗病毒藥物那樣，β-LD4A以其三磷酸化的形式（β-L-D4A-TP）通過(guò)抑制HBV 聚合酶逆轉(zhuǎn)錄的活性來(lái)抑制HBV基因組的復(fù)制。在這項(xiàng)研究中，我們利用Bac-to-Bac 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組H

11、BV 核心顆粒，體外進(jìn)行聚合酶反應(yīng)來(lái)研究β-L-D4A 抑制HBV的的機(jī)制。 方法: 構(gòu)建重組質(zhì)粒所需的外源片斷是HBV聚合酶基因（pol基因）及HBV核心蛋白基因（core基因）片斷。以含HBV全長(zhǎng)基因組的質(zhì)粒P3.6ll為模板PCR擴(kuò)增目的基因片斷。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5％的瓊脂糖凝膠電泳分析，用凝膠回收試劑盒從瓊脂糖凝膠中回收純化擴(kuò)增片斷。將pol基因及core基因片斷插入pFastBac Dua l的兩個(gè)多克隆位點(diǎn)，構(gòu)

12、建pFastBac Dua l-pol-core重組質(zhì)粒。 結(jié)果：（略） 結(jié)論: 本文利用重組HBV核心顆粒進(jìn)行體外聚合酶反應(yīng)來(lái)研究β-L-D4A-TP抗病毒作用的機(jī)理。本研究表明β-L-D4A-TP以濃度依賴(lài)性的方式通過(guò)抑制HBV聚合酶逆轉(zhuǎn)錄活性來(lái)抑制HBV DNA的復(fù)制，但不能排除通過(guò)其他的抑制作用途徑。推測(cè)類(lèi)似于其他作用機(jī)理已闡明的核苷類(lèi)逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，因缺乏合成DNA鏈中磷酸二酯鍵所必需的核苷戊糖環(huán)上3′-OH，