CAT-1作為一種新的細胞粘附分子介導(dǎo)了內(nèi)皮完整性和L-arginine轉(zhuǎn)運.pdf

1、心腦血管疾病如冠心病、高血壓、腦卒中、肺動脈高壓等是人類健康的主要殺手。尋找其有效的干預(yù)措施，是關(guān)系國計民生的迫切需求。該組疾病病因復(fù)雜，大多由遺傳及環(huán)境等多因素所致，但內(nèi)皮完整性受損和內(nèi)皮細胞功能障礙是該組疾病發(fā)生的早期關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
　　內(nèi)皮細胞連接是內(nèi)皮完整性的分子基礎(chǔ)，在調(diào)節(jié)血管功能方面發(fā)揮了重要的作用。在多細胞生物中，細胞連接對于許多生物功能是必需的，如形態(tài)發(fā)生、細胞分化、增殖、凋亡和遷移。超微結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細胞有三種類

2、型細胞連接，即間隙連接(GJs)、緊密連接(TJs)和粘附連接(AJs)。相鄰細胞之間的GJs可以形成跨膜通道，而TJs和AJs則通過跨膜同嗜性粘附作用沿細胞邊緣形成細胞外拉鏈結(jié)構(gòu)。在三種內(nèi)皮細胞連接中，AJs是其主要類型，鈣粘蛋白(cadherins)和連接素(nectins)是已知的AJs之一。然而，針對這些已知分子的干預(yù)措施并不能完全阻斷上述病理狀態(tài)下的內(nèi)皮通透性增加及完整性受損。
　　CAT-1分子家族的第一個成員（小鼠C

3、AT-1，mCAT-1）最初被鑒定為莫洛尼鼠白血病病毒受體(MuLVR)。氨基酸序列同源比較及氨基酸轉(zhuǎn)運功能實驗揭示CAT-1亦是一種鈉離子依賴的陽離子氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白從而介導(dǎo)了陽離子氨基酸如L-arginine(L-Arg)的跨膜轉(zhuǎn)運。L-Arg是細胞NO合成的唯一前體物質(zhì)，在內(nèi)皮細胞中CAT-1作為L-Arg的主要跨膜轉(zhuǎn)運蛋白，通過介導(dǎo)胞外L-Arg的跨細胞膜轉(zhuǎn)運從而增加內(nèi)皮細胞NO產(chǎn)生濃度。NO是一多功能生物活性分子，它通過調(diào)節(jié)血管

4、平滑肌張力、抑制白細胞及血小板與血管內(nèi)皮粘附、抑制血管平滑肌細胞的增生及向內(nèi)膜遷移，在維持血管生理功能中發(fā)揮重要作用。另外，NO通過調(diào)節(jié)多種血管介質(zhì)影響血管內(nèi)皮通透性調(diào)節(jié)，過量表達NO后會增加內(nèi)皮通透性。
　　最近研究顯示，CAT-1在心血管系統(tǒng)疾病中發(fā)揮著重要作用，比如其過表達可以緩解氧化應(yīng)激性內(nèi)皮病理過程和肥胖導(dǎo)致的高血壓等。但是，CAT-1對于血管內(nèi)皮完整性的研究尚未有文獻報道。鑒于過表達CAT-1可以增加內(nèi)皮細胞NO的生成

5、，而過量產(chǎn)生的NO又會增加內(nèi)皮細胞通透性，因此我們猜想CAT-1過表達會增加內(nèi)皮細胞通透性、損傷內(nèi)皮完整性。但是，根據(jù)我們的預(yù)實驗結(jié)果，CAT-1過表達增加了NO的生成，但是并沒有增加內(nèi)皮細胞通透性，相反，降低CAT-1表達后反而增加內(nèi)皮通透性。因此，內(nèi)皮細胞CAT-1可能通過一種不依賴于NO的其他機制參與了內(nèi)皮穩(wěn)定性調(diào)節(jié)，比如穩(wěn)定內(nèi)皮細胞連接等。因此，本課題旨在通過構(gòu)建CAT-1/GFP融合蛋白，研究CAT-1通過何種機制維持了內(nèi)皮通

6、透性。
　　目的:
　　1、構(gòu)建CAT-1/GFP融合表達蛋白，并評價該融合蛋白是否具有野生型CAT-1相一致的生物學(xué)功能;
　　2、分析CAT-1是否通過穩(wěn)定內(nèi)皮細胞連接維持了內(nèi)皮的完整性;
　　3、驗證CAT-1是否具有細胞粘附分子的生化特點及功能特征;
　　4、探討CAT-1轉(zhuǎn)運底物L(fēng)-Arg對其發(fā)揮氨基酸轉(zhuǎn)運和細胞連接功能的影響。
　　方法:
　　第一部分:
　　1.利用PCR方法

7、從內(nèi)皮細胞克隆獲取CAT-1基因序列，將基因片段亞克隆至pENTR1 A/GFP穿梭質(zhì)粒形成CAT-1/GFP融合基因穿梭載體，然后采用Gateway LR重組技術(shù)構(gòu)建獲得腺病毒載體pAd-CAT-1/GFP和慢病毒載體pLenti-CAT-1/GFP，分別轉(zhuǎn)染293A細胞和293FT細胞生產(chǎn)病毒，最后感染PAEC細胞和CHO-S細胞建立過表達CAT-1的細胞模型;
　　2.CAT-1/GFP腺病毒感染豬肺動脈內(nèi)皮細胞(PAEC)

8、，采用同位素方法檢測L-Arg轉(zhuǎn)運和NO生成，評價CAT-1/GFP融合蛋白是否具有野生型CAT-1一致的生物學(xué)功能;
　　3.活細胞共聚焦顯微鏡觀察CAT-1在PAEC細胞的表達及亞細胞定位;
　　4.Western blot用以檢測CAT-1/GFP的單體-二聚體(mono-dimer)形式;蛋白交聯(lián)劑BS3處理CHO-S懸浮細胞，并通過Western blot檢測CAT-1二聚體形式是反式（trans）還是順式（cis

9、）結(jié)合;
　　5.建立穩(wěn)定表達CAT-1/GFP融合蛋白的CHO-S細胞系，采用細胞凝集反應(yīng)檢測CAT-1是否具有促進細胞同源粘附的功能;
　　第二部分:
　　1.利用伊文氏藍-白蛋白(EB-albumin)作為示蹤劑，單層內(nèi)皮細胞通透性實驗用以分析CAT-1對內(nèi)皮細胞通透性的影響;
　　2.活體細胞共聚焦顯微鏡分析L-Arg處理對CAT-1介導(dǎo)的內(nèi)皮細胞連接及其亞細胞定位的影響。
　　結(jié)果:
　　第

10、一部分:
　　1、酶切鑒定及序列測序分析證實CAT-1克隆序列以及CAT-1/GFP融合表達基因正確無誤，并且成功包裝了腺病毒和慢病毒;
　　2、CAT-1/GFP融合蛋白具有與CAT-1一致的生物學(xué)功能
　　成功提取并培養(yǎng)了PAEC細胞，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察及第八因子抗原染色（Ⅷ-R Ag），細胞純度大于95％; PAEC細胞過表達CAT-1/GFP后，與表達GFP對照細胞比較，其L-Arg轉(zhuǎn)運能力增加了9倍(P＜0.01)

11、，NO生成水平升高了5倍(P＜0.01)，說明重組的CAT-1/GFP融合蛋白具有與野生型CAT-1一致的功能;
　　3、CAT-1蛋白主要定位在內(nèi)皮細胞-細胞連接部位
　　PAEC細胞表達CAT-1/GFP，利用共聚焦顯微鏡通過綠色熒光可以發(fā)現(xiàn)CAT-1/GFP主要定位在細胞-細胞連接部位，細胞核周圍的熒光表示新生成的蛋白;CAT-1/GFP表達水平在48-72h達到高峰，可以維持至少7d;同時，免疫細胞熒光染色證實野生型

12、CAT-1也有細胞-細胞連接部位的定位。提示CAT-1可能是一種細胞粘附分子。
　　4、CAT-1蛋白具有反式同源二聚體的特點
　　采用4-20％ SDS-PAGE梯度分離膠分析蛋白樣品，可見CAT-1/GFP有兩種形式存在，一種是大小為190KD的二聚體形式，另一種是大小為95KD的單聚體形式，說明CAT-1/GFP可以發(fā)生同源二聚;而利用BS3蛋白交聯(lián)劑處理單個懸浮CHO-S細胞，CAT-1/GFP蛋白條帶是單一條帶(9

13、5KD)，表明CAT-1/GFP的同源二聚體形式是反式結(jié)合。說明CAT-1具有細胞粘附分子的生化特征。
　　5、CAT-1蛋白具有促進懸浮CHO-S細胞同源粘附的功能
　　用CAT-1/GFP及GFP對照慢病毒分別感染CHO-S細胞，blastidin抗生素篩選獲得穩(wěn)定表達細胞株，細胞凝集反應(yīng)實驗顯示CAT-1/GFP表達細胞株比GFP表達細胞株更容易發(fā)生凝集現(xiàn)象（P＜0.05）。除此之外，CAT家族其他幾個成員，比如CAT

14、-2b、CAT-3和CAT-4也具有促進細胞凝集反應(yīng)的特點，而CAT-4不具有氨基酸轉(zhuǎn)運功能，說明CATs家族促進細胞同源粘附與其氨基酸轉(zhuǎn)運能力無關(guān)。進一步證實CAT-1是一種細胞粘附分子。
　　第二部分:
　　1.降低內(nèi)皮細胞CAT-1表達水平增加內(nèi)皮通透性
　　利用小干擾RNA降低內(nèi)皮細胞CAT-1表達后，EB-albumin通透率升高26±6％，與對照組細胞比較，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);而過表達CAT-1/

15、GFP后，EB-albumin通透率降低趨勢，但是沒有統(tǒng)計學(xué)意義，可能機制是內(nèi)皮細胞基底水平的CAT-1或其它粘附分子足以維持內(nèi)皮細胞完整性;
　　2.L-Arg處理會降低CAT-1內(nèi)置、抑制內(nèi)皮細胞CAT-1介導(dǎo)的細胞連接分離
　　給予內(nèi)皮細胞1mM劑量的L-Arg處理后，與對照組細胞比較，CAT-1/GFP組細胞CAT-1內(nèi)置降低，細胞-細胞連接分離明顯減慢，L-Arg轉(zhuǎn)運能力明顯增加(P＜0.01)，并且同時有CAT-

16、1的膜轉(zhuǎn)位現(xiàn)象發(fā)生。這些實驗結(jié)果說明L-Arg具有穩(wěn)定內(nèi)皮細胞連接的功能，同時也為解釋氨基酸悖論（L-Arg paradox）和反式刺激（trans-stimulation）現(xiàn)象提供了新的依據(jù)。
　　結(jié)論:
　　1.融合蛋白CAT-1/GFP具有與野生型CAT-1一致的生物學(xué)功能，因此可利用抗GFP抗體和綠色細胞熒光研究CAT-1蛋白的亞細胞定位和功能;
　　2.CAT-1是一種新的細胞粘附分子，通過穩(wěn)定內(nèi)皮細胞-細胞