熒光定量PCR檢測嵌合率及微小殘留病方法的建立及與復發(fā)關系的相關性研究.pdf

1、白血病(Leukemia)是在造血干/祖細胞水平轉(zhuǎn)化的一類克隆性惡性血液病。在惡性腫瘤中，其死亡率在男女性分居第6位和第8位，而在青壯年人群中則是威脅生命安全的首要原因，因而越來越受到全世界人們的重視，成為當前研究的熱點。白血病的治療方法包括最基本的聯(lián)合化療及造血干細胞移植。目前聯(lián)合化療對初治白血病的臨床緩解率可以達到80％-90％，造血干細胞移植的成功率也在不斷提高。但是復發(fā)仍然是白血病治療失敗的主要原因。對于治療失敗的患者來說，復發(fā)

2、的根源在于體內(nèi)殘留的白血病細胞，而對于移植的患者供體細胞嵌合率也與移植后的復發(fā)有著緊密的聯(lián)系。 異基因造血干細胞移植(allo-HSCT)是多種血液系統(tǒng)疾病及自身免疫疾病的重要治療手段，而移植成功與否與供體細胞在受者體內(nèi)的植入方式一嵌合狀態(tài)(chimerism)的形成和發(fā)展有關。廣義的講，任何非己成分與自身成分共存的現(xiàn)象，都是嵌合狀態(tài)，但在移植耐受中，嵌合狀態(tài)是指血細胞的嵌合。研究表明allo-HSCT后受者體內(nèi)細胞的存在方式有

3、以下幾種。①完全嵌合狀態(tài)(completechimerism，CC)即供者細胞完全植入，代替了受者細胞；②混合嵌合狀態(tài)(mixedchimerism，Mc)即供受者細胞同時存在于受者體內(nèi)；③完全受者型(recipientcomplete RC)即供者的細胞逐漸被排斥或者消失。幾種嵌合狀態(tài)中，多認為以CC為好，MC與臨床復發(fā)的關系尚存在爭議，一般認為移植后受者細胞比例逐漸增加或CC后再重新檢測到受者細胞成分可能預示疾病晚期復發(fā)。因此嵌合體

4、分析已成為一種證實植入的常規(guī)方法。目前檢測嵌合狀態(tài)的主要方法均是利用了DNA的多態(tài)性，包括①可變數(shù)目串聯(lián)重復序列(variable numbers of tardemrepeats，VNTR)又稱小衛(wèi)星(minisatellite)。②短串聯(lián)重復序列(short tandemrepeats，STR)又稱微衛(wèi)星(microsatellite)。這種方法是目前最常用的方法且具有很高的準確性。③限制性片段長度多態(tài)性(RELP)。④缺失或插入雙

5、等位基因多態(tài)性(Indels)和單鏈核苷酸多態(tài)性(SNPs)。Indels和SNP的多態(tài)性分析均可以用熒光定量方法進行，因此利用Indels和SNP的多態(tài)性可以把熒光定量PCR技術引入嵌合體的檢測，以提高靈敏度和準確度。 慢性粒細胞白血病，是伴有獲得性染色異常的多能干細胞水平上的惡性變引起的一種惡性血液病。Ph染色體是慢粒的特異性染色體畸變，95％以上的本病患者存在t(9；22)(q34；q11)，形成bcr/abl融合基因，編

6、碼產(chǎn)生P210蛋白，P210蛋白能夠增強酪氨酸激酶的活性，導致粒細胞轉(zhuǎn)化和過度增殖，從而導致慢粒。格列衛(wèi)是一種專門針對Ph染色體陽性白血病的特異性藥物，主要功能是抑制酪氨酸激酶的活性，已用于慢粒的臨床治療。根據(jù)上述原理，bcr/abl融合基因的表達變化情況既可以反映患者體內(nèi)殘留的白血病細胞水平，同時可反映臨床治療比如格列衛(wèi)的效果。目前尚未見格列衛(wèi)治療期間bcr/abl融合基因的表達變化情況的動態(tài)觀察報道。 本文的實驗目的包括:

7、①建立造血干細胞移植后熒光定量PCR檢測嵌合狀態(tài)的相對定量方法，以及RQ-RT-F)CR監(jiān)測殘留白血病的絕對定量方法。②利用實時熒光定量PCR技術對移植后供體細胞嵌合率以及慢粒應用格列衛(wèi)治療前后的BCR/ABL融合基因的表達情況進行了檢測，并分析了其相關性，為臨床監(jiān)測白血病的復發(fā)提供理論依據(jù)。 第一部分：熒光定量PCR檢測移植后嵌合體方法的建立及與復發(fā)的相關性研究 近來在人類基因組中，許多具有缺失或插入多態(tài)性的雙等位基因

8、被發(fā)現(xiàn)。利用這種多態(tài)性作為區(qū)別不同個體的基因marker，我們建立了檢測移植后嵌合率的熒光定量PCR方法。首先在基因庫中選擇了具有缺失或插入多態(tài)性的四條基因，SRY、Xq28、GSTMl、GSTT1。其中SRY僅在男性體內(nèi)存在，Xq28、GSq、M1、GSTT1的缺失率文獻報道分別為(30％、47％、17％)。分別在四條基因的缺失序列上設計引物及探針，同時也為管家基因β-globin設計好引物及探針。選取臨床患者外周血標本，常規(guī)方法提取

9、DNA，-20℃保存?zhèn)溆?。隨機選擇備用DNA標本，分別對SRY、Xq28、GSTM1、GSTT1及管家基因β-globin進行定性PCR擴增，將擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，切膠純化、回收目的產(chǎn)物，連接T載體，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，LB培養(yǎng)基，37C°，150rpm震蕩14-16小時，提取質(zhì)粒測濃度后備用。質(zhì)粒同時送三博公司測序。將不同基因的質(zhì)粒按2倍倍比稀釋后進行熒光定量檢測，作出各基因的標準曲線，并得到各基因的擴增效率E。文中17例標本為供

10、受者性別不符，用SRY基因進行檢測。14例供受者性別相符標本在預試驗中已驗證可用Xq28、GSTM1、GSTT1三種基因?qū)┦苷哌M行區(qū)分。以移植前目的基因與管家基因的比值為原始參照，移植后不同時間點的相應值與之進行比較得到數(shù)據(jù)。并與STR方法的結果進行了比較。結果證明該方法敏感性可達10<'-4>-10<'-5>,結果與STR相比基本一致，但該方法更準確、快速、敏感。移植后復發(fā)患者的嵌合率在不同時間段的檢測結果具有明顯的下降趨勢，差異具

11、有顯著性(P<0.05)。這種趨勢在外周血與骨髓中是一致的，但骨髓較外周血提前，因此嵌合率的下降可預示復發(fā)。復發(fā)多發(fā)生在移植后60天左右。 第二部分：熒光定量PCR檢測BCR/ABL融合基因方法的建立及該融合基因mRNA表達水平的變化與CML患者格列衛(wèi)治療效果的相關性研究 Ph染色體是慢粒的特征性染色體畸變，9號染色體和22號染色體長臂的異位導致位于9號染色體上的BCR基因與位于22號染色體上的ABL基因融合形成BCR/

12、ABL融合基因。這種融合基因共有三種融合類型，b2a2，b3a2，ela2，其中前兩種類型可覆蓋95％的慢性粒細胞白血病患者，不僅可以用來輔助臨床診斷，還可以用來監(jiān)測患者體內(nèi)的殘留白血病細胞，從而預測復發(fā)。本章建立一種可以特異的對b2a2，b3a2兩種類型融合基因進行檢測的實時熒光定量PCR方法。選擇K562細胞系，常規(guī)方法提取RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，在兩種類型的融合基因的共有區(qū)域設立上下游引物和探針，進行BCR/ABL以及管家基因GA

13、DPH的定性PCR，將擴增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上進行電泳，之后將目的條帶切下利用試劑盒將目的基因序列純化回收。將BCR/ABL序列和GADPH與PGM-T載體連接形成質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，LB培養(yǎng)基，37℃，150rpm震蕩14-16小時，提取質(zhì)粒后測濃度，并測量出拷貝數(shù)倍比稀釋為10<'7>，10<'6>，10<'5>，10<'4>，10<'3>，10<'2>，10等不同梯度待用。選擇臨床確診的慢性粒細胞白血病應用格列衛(wèi)治療的患者，留取治療

14、前及治療后7天、14天、21天、1個月、2個月的外周血，F(xiàn)icol分離單個核細胞，提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA備用。選取10<'6>，10<'5>，10<'4>，10<'3>，10<'2>，的BCR/ABL和GADPH質(zhì)粒進行熒光定量PCR作出標準曲線，利用管家基因作為外參照，測出不同時期BCR/ABL融合基因表達水平。 結果：格列衛(wèi)治療前后不同時間點，BCR/ABL融合基因的表達水平呈明顯下降趨勢，治療前后兩組數(shù)據(jù)進行t檢驗，