PTPN22-1123G＞C與廣東地區(qū)人群RA易感性及血清學(xué)指標(biāo)的關(guān)聯(lián)性研究.pdf

1、研究背景和目的：:
　　 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎為特征的慢性全身性自身免疫性疾病。以慢性、對稱性、多滑膜關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)外病變?yōu)橹饕R床表現(xiàn),滑膜炎持久反復(fù)發(fā)作,可導(dǎo)致關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨和骨的破壞,關(guān)節(jié)功能障礙,甚至殘廢。該病好發(fā)于手、腕、足等小關(guān)節(jié),反復(fù)發(fā)作,呈對稱分布。血管炎病變累及全身各個(gè)器官,故本病又稱為類風(fēng)濕病。RA呈全球性分布,國外本病的患病率約為1％～2％,我國初步調(diào)

2、查發(fā)現(xiàn)患病率為0.32％～0.34％,雖低于國外,但由于我國人口眾多,估計(jì)患者總數(shù)約有360萬之多,如此龐大的RA患病人群每年都給我國社會(huì)、經(jīng)濟(jì)造成巨大的損失,也是造成我國人群喪失勞動(dòng)力和致殘的主要病因之一。RA病因未明,目前多認(rèn)為遺傳、感染、環(huán)境和激素四大因素的交互作用是參與RA發(fā)病的重要因素,文獻(xiàn)報(bào)道遺傳因素可以解釋的易感性占50-60％。
　　 最近研究發(fā)現(xiàn),蛋白酪氨酸磷酸酶非受體型22(protein tyrosine

3、phosphatasenonreceptor 22,PTPN22)基因的一個(gè)單核苷酸多態(tài)性,即1858C轉(zhuǎn)換為1858T(rs2476601),使密碼子620編碼的P1基序中一個(gè)高度保守的關(guān)鍵氨基酸由精氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)樯彼?R620W),導(dǎo)致Lyp不能正常發(fā)揮作用,增加了個(gè)體對自身免疫性疾病的易感性。PTPN22基因定位于1號染色體短臂1區(qū)3帶(1p13.1～1p13.3)上,編碼淋巴細(xì)胞特異性的蛋白酪氨酸磷酸酶(lymphoid prot

4、eintyrosine phosphatase,Lyp)。LYP從屬于蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs)家族,是造血組織細(xì)胞特異性的PTPs,LYP主要通過C端命名為P1的富含脯氨酸基序與CSK蛋白酪氨酸激酶的SH3結(jié)構(gòu)域連接,使已磷酸化的Src家族Lck、Fyn和ZAP-70激酶脫磷酸化,同時(shí)協(xié)同CSK抑制T細(xì)胞活化,在T細(xì)胞活化的信號傳導(dǎo)中起到重要的負(fù)調(diào)節(jié)作用,一旦PTPN22基因發(fā)生變異,Lyp的功能或表達(dá)量發(fā)生改變,可引起T細(xì)胞信號傳

5、導(dǎo)障礙,導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生。
　　 為此,本課題擬增加RA患者病例數(shù),同時(shí)我們還選取國外文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)的與自身免疫性疾病相關(guān)聯(lián)的新的PTPN22基因SNP位點(diǎn)(rs33996649和rs1310182),采用PCR-RFLP技術(shù)結(jié)合測序技術(shù)來檢測這三個(gè)位點(diǎn)在RA患者和健康人群中中的分布差異,分析它們與廣東地區(qū)人群RA發(fā)病的相關(guān)性；采用熒光定量PCR技術(shù)對PTPN22基因的表達(dá)水平進(jìn)行相對定量來了解rs2488457/-1123

6、G>C與基因表達(dá)之間的關(guān)聯(lián)；聯(lián)合RF、anti-CCP、GPI、血沉(ESR)和C-反應(yīng)蛋白(CRP)等的檢測,研究其早期診斷價(jià)值及特異性,為臨床RA的早期診斷、治療提供依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.研究對象
　　 收集廣州南方醫(yī)院風(fēng)濕科2008年1月～2010年1月門診及住院RA患者494例,其中男性75例,女419例,年齡3～84歲,平均年齡44.99±0.65歲；所有RA患者均符合1987年美國類風(fēng)濕病協(xié)

7、會(huì)(ARA)修訂的RA診斷分類標(biāo)準(zhǔn)及2009年ACR/EULAR聯(lián)合頒布新的RA診斷標(biāo)準(zhǔn)。對照組選擇496例健康查體者,男性99例,女性397例,年齡7～82歲,平均年齡:43.52±0.60。研究對象均為廣東地區(qū)漢族人群,無親緣關(guān)系,兩組年齡、性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05),健康對照組排除了除RA外的自身免疫性疾病患者。
　　 2.研究方法:
　　 2.1 采用PCR-RFLP技術(shù)結(jié)合測序技術(shù)檢測三種SNP基因型

8、
　　 選取國外文獻(xiàn)中新發(fā)現(xiàn)與自身免疫性疾病相關(guān)聯(lián)的PTPN22基因SNP位點(diǎn)(rs2488457,rs33996649和rs1310182),采用PCR-RFLP技術(shù)結(jié)合測序技術(shù)來檢測這三個(gè)位點(diǎn)在兩組中的分布。根據(jù)SNP位點(diǎn)上是否存在核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn),利用軟件primer premier 5.0設(shè)計(jì)針對三種SNP靶片段上的引物,對研究對象的DNA進(jìn)行擴(kuò)增,用核酸內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物,消化產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。隨機(jī)抽取

9、10％測序,與PCR-RFLP結(jié)果對比。
　　 2.2 采用SYBR Green熒光染料法檢測PTPN22基因相對表達(dá)量
　　 根據(jù)PTPN22 mRNA序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物,以管家基因GAPDH為內(nèi)參,采用2-△△CT分析方法對PTPN22基因的表達(dá)量進(jìn)行相對定量。比較PTPN22mRNA的相對表達(dá)量在-1123G>C三種基因型之間的差別。
　　 2.3 采用ELISA法檢測患者血漿GPI水平
　　 收集患

10、者血清,以PTPN22-1123G>C多態(tài)性位點(diǎn)將RA分為三組,另外設(shè)置健康對照組和非RA的自身免疫性疾病對照組,共5組,用ELISA法檢測各組血漿樣本中GPI的相對表達(dá)量。
　　 2.4 臨床特征分析
　　 以PTPN22 G-1123C多態(tài)性位點(diǎn)將RA分為三組,同時(shí)我們以RF、anti-CCP、血沉(ESR)、C-反應(yīng)蛋白(CRP)、X線損傷等指標(biāo)陽性時(shí)和陰性時(shí),比較PTPN22 G-1123C多態(tài)性位點(diǎn)的基因型分布

11、在病例組和對照組之間的差異。
　　 3.統(tǒng)計(jì)方法
　　 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,計(jì)數(shù)資料用率表示。RA組及健康對照組三個(gè)SNP位點(diǎn)基因型頻率經(jīng)Hardy-WeinbeB遺傳平衡定律檢驗(yàn)樣本是否具有群體代表性；三個(gè)SNP位點(diǎn)基因型分布以及等位基因頻率在兩組之間的比較采用R×C列聯(lián)表的x2檢驗(yàn)；對于樣本含量<40和理論數(shù)<1的計(jì)數(shù)資料采用列聯(lián)表的精確概率法；各組間均數(shù)比較

12、采用單因素方差分析(one-way ANOVA),方差分析顯著時(shí)進(jìn)行多重比較,方差齊采用Bonferroni法,方差不齊采用Games-howell法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；構(gòu)成比的比較采用卡方分析(Chi-square test)。
　　 結(jié)論:
　　 1.PTPN22-1123G>C與廣東地區(qū)漢族人群RA的發(fā)病有關(guān)聯(lián),并且具有明顯的雜合子優(yōu)勢,由于CG基因型在RA和對照組中的分布分別為45.7％和37.5

13、％,說明PTPN22-1123G>C可能只是一種低危險(xiǎn)度的SNP。PTPN22-1123G>C與中國人群RA易感性的關(guān)聯(lián)可能具有普遍性。
　　 rs1310182與中國廣東人群RA發(fā)病不具有關(guān)聯(lián)性。
　　 rs33996649與中國廣東人群RA發(fā)病無關(guān)聯(lián)性。
　　 2.PTPN22-1123G>C可能使PTPN22 mRNA的表達(dá)異常,而且,PTPN22mRNA和血清GPI的變化趨勢一致,表明Lyp的表達(dá)量與GP

14、I的產(chǎn)生具有相關(guān)性。
　　 3.我們尚未發(fā)現(xiàn)PTPN22-1123G>C與RA患者anti-CCP、ESR、CRP以及X線損傷之間的關(guān)聯(lián)。
　　 本研究創(chuàng)新點(diǎn):
　　 1.增加了大量的病例數(shù)進(jìn)一步證實(shí)PTPN22-1123G>C多態(tài)性與中國廣東人群RA發(fā)病相關(guān)。
　　 2.發(fā)現(xiàn)PTPN22-1123G>C多態(tài)性可能改變PTPN22啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能。野生型G等位基因轉(zhuǎn)變?yōu)镃等位基因后,表達(dá)下調(diào)。