神經(jīng)細(xì)胞來(lái)源Microparticles在顱腦創(chuàng)傷相關(guān)凝血功能障礙發(fā)生中的機(jī)制研究.pdf

1、目的:目前國(guó)際上尚缺乏顱腦創(chuàng)傷(traumatic brain injury，TBI)相關(guān)凝血功能障礙明確的發(fā)生機(jī)制及有效的治療方法。本實(shí)驗(yàn)將通過(guò)建立中型TBI小鼠模型，觀察循環(huán)血中神經(jīng)細(xì)胞來(lái)源microparticles(brain-derived microparticles，BDMP)含量及凝血功能變化，結(jié)合體外制備BDMP的方法，體外研究BDMP的促凝作用，與血小板的相互作用及Lactadherin蛋白對(duì)BDMP的清除作用。試圖

2、闡明TBI相關(guān)凝血功能障礙的物質(zhì)基礎(chǔ)，明確TBI相關(guān)凝血功能障礙的發(fā)生機(jī)制，探討建立預(yù)防治療TBI引起的凝血功能障礙的新方法，成為研究TBI相關(guān)凝血功能障礙機(jī)制的新方向。
　　方法:1)建立中型TBI小鼠模型，應(yīng)用流式細(xì)胞儀和活化因子X(jué)凝血時(shí)間實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)TBI小鼠循環(huán)血中BDMP含量及凝血功能的變化;2)應(yīng)用腦組織勻漿分步離心的方法體外制備BDMP;3)應(yīng)用透射電鏡、流式細(xì)胞儀和Western Blot方法鑒定所得BDMP的形態(tài)學(xué)

3、及表型;4)應(yīng)用活化因子X(jué)凝血時(shí)間實(shí)驗(yàn)和凝血酶生成實(shí)驗(yàn)，體外檢測(cè)BDMP的促凝作用;5)經(jīng)鼠尾靜脈注射BDMP到正常小鼠體內(nèi)，應(yīng)用活化因子X(jué)凝血時(shí)間實(shí)驗(yàn)、血漿纖維蛋白原水平測(cè)定和病理PTAH染色方法，體內(nèi)檢測(cè)BDMP的促凝作用;6)應(yīng)用流式細(xì)胞儀和掃描電鏡觀察BDMP與血小板的結(jié)合情況;7)應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)BDMP對(duì)血小板的活化作用。8)應(yīng)用Transwell小室系統(tǒng)檢測(cè)BDMP在血小板介導(dǎo)下穿透HUVEC細(xì)胞的能力;9)應(yīng)用流式細(xì)胞

4、儀和活化因子X(jué)凝血時(shí)間實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Lactadherin蛋白對(duì)BDMP的清除作用。
　　結(jié)果:1)TBI小鼠循環(huán)血中BDMP呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢(shì)，在TBI后3h時(shí)其表達(dá)達(dá)到頂峰。小鼠TBI后3h的貧血小板血漿(platelet poor plasma，PPP)其凝血時(shí)間明顯縮短，此時(shí)PPP中BDMP的表達(dá)最高。而在經(jīng)過(guò)超速離心將BDMP去除后，無(wú)MP血漿(MP-free plasma，MPFP)的凝血時(shí)間明顯延長(zhǎng);2)透射電鏡下BD

5、MP具有完整的膜結(jié)構(gòu)，且表面表達(dá)大量的膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)。流式細(xì)胞及Western Blot結(jié)果顯示BDMP表達(dá)大量的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)記，而不表達(dá)血小板、紅細(xì)胞、白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志物。BDMP上磷脂酰絲氨酸(PS)和組織因子在體外具有促凝作用。最后將BDMP注射到正常小鼠體內(nèi)，小鼠PPP的凝血時(shí)間明顯延長(zhǎng)，血漿纖維蛋白原明顯降低，組織中纖維素沉積明顯;

6、3)流式細(xì)胞儀和掃描電鏡觀察到BDMP能夠與血小板結(jié)合，其結(jié)合后可以促進(jìn)血小板表面PS的表達(dá)增加，同時(shí)可以激活血小板，導(dǎo)致血小板活化標(biāo)志P-選擇素表達(dá)增加和鈣離子內(nèi)流增加。反過(guò)來(lái)，激活的血小板可以介導(dǎo)BDMP穿透激活的HUVEC細(xì)胞;4)Lactadherin蛋白可以和BDMP結(jié)合，并在結(jié)合后減弱BDMP的促凝作用。
　　結(jié)論:1)TBI小鼠循環(huán)血中檢測(cè)到具有促凝活性的BDMP，可能是發(fā)生TBI相關(guān)凝血功能障礙的物質(zhì)基礎(chǔ);2)通過(guò)