腫瘤壞死因子凋亡相關配體（TRAIL）對乙肝病毒復制過程影響的初探.pdf

1、目的:腫瘤壞死因子凋亡相關配體(TNF-related apoptosis inducingligand，TRAIL)是近年發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死因子家族的一員，在正常人體組織中廣泛存在，主要參與機體的免疫自穩(wěn)定、免疫監(jiān)控和免疫應答的調節(jié)，但對正常組織細胞基本無毒副作用，而主要選擇性作用于腫瘤細胞，促進其凋亡。 鑒于有學者報道，TRAIL表達的降低可能與HBV感染的慢性化有關，我們推測，TRAIL可能在抑制乙肝病毒復制方面發(fā)揮某種作用。

2、為此，作者采用肝癌細胞株HepG2及其同種系的HepG2.215建立體外細胞模型，就TRAIL分子對HBV復制與轉錄的影響及其與凋亡的關系作了初步探索，希望可以為抗乙肝病毒治療找到新思路。 方法: 1．研究sTRAIL對HBV DNA轉錄、復制和表達的影響。將具有相同遺傳背景的肝癌細胞株HepG2．215和HepG2細胞作為體外模型，使2.5～20ng/ml sTRAIL分別作用于已與HBV基因組整合的HepG2.215

3、和轉染了乙肝病毒pHBV4.1的HepG2細胞，通過ELISA測定HepG2.215細胞培養(yǎng)上清中HBsAg、HBeAg量的變化情況(加sTRAIL 0～5天)；通過免疫組化觀察HepG2細胞分泌HBsAg、HbcAg的變化情況(加sTRAIL 48h后)；用Southern核酸吸印雜交檢測HepG2.215和HeDG2細胞中HBV復制中間體水平，Northern核酸吸印雜交檢測HepG2細胞中3.5kb、2.4kb、2.1kb和0.7

4、kb HBV mRNA的轉錄水平(加sTRAIL 48h后)。 2．用乙肝病毒全基因重組質粒pHBV4.1轉染HepG2細胞，加入sTRAIL(10、20、100、200、1000ng/ml)作用48h后，以電泳觀察DNALadder形成實驗，了解不同濃度的sTRAIL誘導細胞凋亡的情況。 結果: 1．Southern核酸吸印雜交的結果顯示，與未加sTRAIL的對照組相比，10ng/ml sTRAIL作用48h后

5、的實驗組(已與HBV基因組整合的HepG2.215或轉染了乙肝病毒pHBV4.1的HepG2細胞)中的HBV復制中間體rcDNA、ssDNA均下降了3～20倍；Northern核酸吸印雜交的結果顯示，與未加sTRAIL的對照組相比，加了10ng/ml sTRAIL作用48h后的實驗組(轉染了乙肝病毒pHBV4.1的HepG2細胞)中的HBV前基因組RNA(即3.5kb RNA)的轉錄水平下降了5～20倍。 2．ELISA檢測結果

6、顯示。加入不同濃度(0、2.5、5、10、20ng/ml)sTRAIL作用于HepG2.215細胞后，對其分泌HBsAg、HBeAg量進行連續(xù)5天的觀察，各濃度組檢測結果進行方差分析和兩兩比較后提示：與不加sTRAIL組相比，在2.5、5、10、20ng/ml范圍內，加入sTRAIL后，第1天起HBsAg分泌量即均顯示減少(p<0.01)；且隨加入sTRAIL劑量的增加，HBsAg分泌量的減少更趨明顯(p<0.05)，顯示出藥效/濃度依

7、賴性。另一方面，與不加sTRAIL組相比，在2.5、5、10、20ng/ml范圍內，加入sTRAIL后，從第3天起，5、10、20ng/ml組的HBeAg分泌量均顯示減少(P<0.05)；但sTRAIL各劑量組之間兩兩比較，HBeAg的分泌量沒有顯著性差異(p>0.05)。 3．免疫組化檢測結果顯示。10ng/ml sTRAIL作用于HepG2細胞48小時后，免疫組化檢測觀察到細胞中HBsAg、HbcAg分泌量表達明顯減少。

8、 4．LADDER實驗結果提示，sTRAIL誘導HepG2細胞(已轉染乙肝病毒pHBV4.1)凋亡的現(xiàn)象呈濃度依賴性。加入sTRAIL 100ng/ml組作用48小時后，則可見LADDER條帶，表明HepG2細胞已出現(xiàn)可檢測的凋亡；加入sTRAIL 200ng/ml組作用48小時后，LADDER條帶明顯變強。但是，在上述可以產(chǎn)生HBV復制及表達抑制現(xiàn)象的sTRAIL濃度10、20ng/ml組作用48小時后，HepG2細胞未見明顯凋亡

9、。 結論: 10ng/ml sTRAIL作用48小時后可使轉染了pHBV4.1的HepG2細胞分泌HBsAg、HBcAg量減少，HBV復制中間體DNA和轉錄產(chǎn)物3.5kb mRNA水平降低；HepG2.215細胞HBV復制中間體DNA生成減少。而2.5～20ng/ml濃度范圍內sTRAIL作用48小時后，HepG2/215細胞分泌HBsAg、HBeAg量下降；且HBsAg下降趨勢呈sTRAIL濃度依賴性。另由LADDER