疏水改性普魯蘭多糖及其自組裝載藥納米粒的研究.pdf

1、天然多糖具有親水、安全、穩(wěn)定、無毒、生物可降解性、自然界存在廣泛、易制備和價格便宜等優(yōu)點；同時，多糖分子鏈有較多不同種類的基團，經(jīng)化學和生化方法修飾，可獲得相應(yīng)的功能化多糖衍生物。因此，應(yīng)用多糖及其衍生物作為藥物載體的研究報告日益增多。普魯蘭多糖具有水溶性、無毒、多羥基易化學修飾和缺少免疫原性等優(yōu)點，可做藥物載體。內(nèi)源性膽固醇分子具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致分子有一定的疏水性。而選擇人體內(nèi)源性小分子琥珀酸為連接臂代替文獻報道的1，6—己二異氰酸酯

2、，將膽固醇接枝到普魯蘭多糖分子鏈上，獲得新型安全的兩親性膽固醇基普魯蘭(CHSP)，此方法也為膽固醇基普魯蘭的合成提供了新策略。本研究具體內(nèi)容如下： ⑴合成新型兩親性膽固醇基普魯蘭(CHSP)、膽固醇基羧甲基普魯蘭(CHS—CMP)和FITC標記的CHSP(FITC—labeled CHSP)的普魯蘭糖衍生物。用紅外(FT—IR)、核磁共振(NMR)、粉末晶體衍射(XRD)、差示掃描量熱儀(DSC)、紫外—可見分光光度計和熒光分

3、光光度計對合成普魯蘭衍生物進行表征。通過FT—IR、NMR、XRD和DSC實驗證明，合成了兩親性膽固醇基普魯蘭。用NMR法和硫酸銨比色法計算系列CHSP的膽固醇取代度，每100糖單元取代3.87～5.70個膽固醇。采用琥珀酸連接臂，合成膽固醇基羧甲基普魯蘭(CHS—CMP)，并對其中間體和CHS—CMP材料進行FT—IR和1H NMR表征。以CHSP和FITC為原料，在二月桂酸二丁基錫(DBTDL)催化下，合成FITC—labeled

4、CHSP并經(jīng)FT—IR和1H NMR表征，通過NMR和熒光分光光度法計算衍生物的FITC取代度，每100糖單元取代4.3個FITC。 ⑵通過溶脹超聲法或透析法制備CHSP和FITC—labeled CHSP自聚集水凝膠納米粒。用1H NMR、動態(tài)激光散射(DLS)、透射電鏡(TEM)和穩(wěn)態(tài)熒光探針法對CHSP納米粒物化性質(zhì)進行表征。由于CHSP材料的膽固醇取代度不同，獲得粒徑在51.8～73 nm自聚集水凝膠納米粒。CHSP分子

5、結(jié)構(gòu)中無極性取代基，其納米粒在蒸餾水中的zeta電位絕對值近似為零。而CHSP材料的臨界聚集濃度(cac)的大小直接與膽固醇取代度有關(guān)，當膽固醇取代度增大，cac濃度減小。采用透析法可制備粒徑在50nm左右的FITC—labeled CHSP自聚集納米粒。 ⑶載藥CHSP和載藥FITC—labeled CHSP自聚集納米粒的制備。用動態(tài)激光散射(DLS)、透射電鏡(TEM)、紫外—可見分光光度計(UV—Vis)、XRD粉末晶體衍

6、射和差示掃描量熱(DSC)對載藥納米粒進行表征。以米托蒽醌(MTO)作為抗瘤模型藥物，用透析法制備CHSP載藥納米粒。動態(tài)光散射測得載藥納米粒的粒徑為153.1～174.2 nm。UV—Vis法檢測載藥納米粒的包封率為83.3～91.7％，載藥量為4.35％～14.29％。透射電鏡下觀察，載藥CHSP納米粒為規(guī)則的球形。隨著CHSP材料膽固醇取代度增大，納米粒的載藥量和包封率均增大。對照MTO藥物晶體衍射峰，載藥CHSP納米粒的MTO藥

7、物的晶體峰消失，XRD結(jié)果表明，負載的MTO包入納米粒內(nèi)部。DSC實驗結(jié)果同樣證明這一結(jié)論。載藥CHSP納米粒的體外釋放顯示，MTO釋放與釋放介質(zhì)的pH有關(guān)，pH低的釋放介質(zhì)藥物釋放快。但在pH6.8或7.4釋放介質(zhì)中，能緩慢釋放MTO。藥物釋放與載體CHSP的膽固醇取代度有關(guān)，取代度越大，載藥納米粒緩釋效果越明顯。采用離子梯度法，用CHSP納米粒包載強熒光性的表阿霉素(EPI)，與包載MTO的CHSP納米粒相比，包載EPI納米粒的載藥

8、量和包封率都偏低。用透析法制備了負載EPI的FITC—labeled CHSP納米粒。 ⑷CHSP自聚集納米粒、載藥CHSP自聚集納米粒和載藥FITC—labeled CHSP納米粒的細胞實驗評價。采用MTT、激光共聚焦顯微鏡、流式細胞儀對細胞實驗進行評價。向HeLa腫瘤細胞中加入高達200μg/mL的CHSP自聚集水凝膠納米粒的培養(yǎng)基，此濃度的CHSP納米粒對共孵育的HeLa細胞的生長無抑制作用；無論是MTO還是EPI載藥納米

9、粒，當載藥納米粒中藥物濃度在1～10μg/mL，均顯示出對HeLa細胞的毒性。將相同藥物濃度的載藥CHSP納米粒和藥物溶液的培養(yǎng)基加入HeLa細胞中，共孵育相同時間，載藥納米粒對腫瘤細胞生長抑制作用強于游離藥物。流式細胞儀檢測結(jié)果表明，腫瘤細胞對于載藥納米粒吞噬作用強于游離藥物。激光共聚焦顯微鏡下觀測的結(jié)果同樣證明這一結(jié)論。為了觀測CHSP材料自聚集水凝膠納米粒進入HeLa細胞的情況，選擇50 nm左右的FITC—labeled CHS

10、P自聚集水凝膠納米粒與HeLa細胞共孵育，隨孵育時間延長，在激光共聚焦顯微鏡下可觀測到納米粒由粘附于腫瘤細胞膜，逐漸進入細胞漿，直到最后分布包括細胞核在內(nèi)的整個細胞。而觀測負載表阿霉素的FITC—labeled CHSP納米粒與HeLa細胞共孵育2h的照片，發(fā)現(xiàn)藥物和CHSP納米粒均可進入腫瘤細胞核。 ⑸負載表阿霉素CHSP自聚集水凝膠納米粒的wistar大鼠藥代實驗初步研究。采用高效液相法檢測不同時間游離EPI和載藥的CHSP