轉(zhuǎn)染丙型肝炎病毒NS2基因?qū)θ烁渭?xì)胞及環(huán)境中巨噬細(xì)胞的影響.pdf

1、目的:丙型肝炎病毒(HepatitisCvirus，HCV)于1989年被Choo等發(fā)現(xiàn)，到目前為止，全球約有1.7億人感染，占世界人口的2～3％。我國也是丙型肝炎高發(fā)區(qū)，健康人群中抗HCV陽性率為3.2％。HCV感染的慢性化率較高，由此增加了發(fā)展為肝纖維化、肝硬化和肝細(xì)胞癌(HepatocellularCarcinoma，HCC)及其他相關(guān)致死性肝病的風(fēng)險。
　　丙型肝炎病毒(HCV)屬黃病毒科，基因組為單股正鏈RNA，含有一個

2、開放閱讀框，編碼一個多聚蛋白前體，后者在病毒自身蛋白酶和宿主蛋白酶的作用下被切割為結(jié)構(gòu)蛋白core、E1、E2、p7，和非結(jié)構(gòu)蛋白NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B一共10種病毒蛋白。作為連接HCV結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白關(guān)鍵部分的NS2蛋白一直是研究的熱點(diǎn)，其氨基端依賴于宿主信號肽切割，羧基端則由NS2-NS3蛋白酶催化自身切割與NS3分離而釋放。釋放出的具有功能的NS2蛋白為病毒感染細(xì)胞所必需，還可參與調(diào)控宿主細(xì)胞的

3、增殖和基因表達(dá)。Erdtmann等發(fā)現(xiàn)NS2與肝臟特異的促凋亡因子CIDE-B(celldeath-inducingDFFA-likeeffectorB)相互作用，抑制CIDE-B誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。NS2還可抑制IFN-β基因啟動子的活性，從而阻止宿主體內(nèi)信號通路發(fā)揮抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等作用。本研究應(yīng)用HCV2a型JFH-1株基因為模板，構(gòu)建了HCVNS2真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1-NS2，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染人肝細(xì)胞株L02，并獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)

4、染的單克隆株，從對L02增殖水平及所分泌細(xì)胞因子的影響角度了解NS2對宿主細(xì)胞的作用。
　　肝臟中存在枯否氏細(xì)胞（巨噬細(xì)胞）、NK細(xì)胞等固有免疫細(xì)胞，它們在機(jī)體抗病毒感染中發(fā)揮著重要的作用，但多個研究表明，HCV在肝臟微環(huán)境中可通過自身蛋白干擾免疫細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而抑制免疫應(yīng)答，有利于持續(xù)存在于宿主體內(nèi)。本研究通過應(yīng)用transwell小室將轉(zhuǎn)染NS2基因的L02細(xì)胞與人巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，從不同水平檢測巨噬細(xì)胞變化，旨在研究HCV

5、NS2蛋白、肝細(xì)胞、巨噬細(xì)胞三者在肝臟微環(huán)境中的相互作用，以期為以HCV為基礎(chǔ)的肝細(xì)胞癌發(fā)生機(jī)制和HCV免疫逃逸研究提供新的視角。
　　方法:
　　1、從JFH-1株(HCV2a)全長基因質(zhì)粒上通過PCR方法擴(kuò)增HCVNS2基因，連接至pMD18-T載體，測序正確后，經(jīng)BamHⅠ、HindⅢ雙酶切，將其克隆至真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1，構(gòu)建重組真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1-NS2，經(jīng)HindⅢ、BamHⅠ雙酶切后瓊脂糖電泳

6、鑒定并測序。
　　2、分別提取及純化pEGFP-C1-vector和pEGFP-C1-NS2質(zhì)粒，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞株L02并G418藥物篩選，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的單克隆細(xì)胞L02(pEGFP-C1-vector)和L02(pEGFP-C1-NS2)。通過熒光顯微鏡觀察GFP蛋白熒光強(qiáng)度，提取細(xì)胞總RNA后PCR檢測目的基因GFP-NS2，提取細(xì)胞總蛋白行Westernblot檢測GFP-NS2融合蛋白的表達(dá)以鑒定。
　　3

7、、體外培養(yǎng)L02、L02(pEGFP-C1-vector)和L02(pEGFP-C1-NS2)三種細(xì)胞，待對數(shù)生長期，消化計數(shù)后接種于96孔板（1×104個/孔），分別于培養(yǎng)24h，48h，72h時，每孔加入MTS溶液20μl，37℃培養(yǎng)箱孵育4h，吸取孔內(nèi)培養(yǎng)液，用酶標(biāo)儀檢測490nm處的吸光度值，MTS法檢測不同時間點(diǎn)肝細(xì)胞增殖的動態(tài)變化。
　　4、體外培養(yǎng)L02、L02(pEGFP-C1-vector)、L02(pEGFP-

8、C1-NS2)三種細(xì)胞，待對數(shù)生長期，消化計數(shù)后接種于6孔板（1×106個/孔），24h后提取細(xì)胞總RNA，Real-timePCR檢測細(xì)胞因子（IL-8、IL-10、TGF-β）mRNA水平變化。
　　5、將L02、L02(pEGFP-C1-vector)、L02(pEGFP-C1-NS2)三種細(xì)胞，與巨噬細(xì)胞THP1共培養(yǎng)，并設(shè)單獨(dú)培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞THP1為對照。于共培養(yǎng)6h、10h后，收取巨噬細(xì)胞THP1提取總RNA，Real

9、-timePCR檢測細(xì)胞因子（IL-1β、IL-8、IL-10、TGF-β）mRNA水平變化;于共培養(yǎng)12h、24h后，取巨噬細(xì)胞THP1上清，使用CBAHumanInflammatoryCytokinesKit檢測巨噬細(xì)胞THP1分泌的炎性細(xì)胞因子的變化;于共培養(yǎng)12h、24h后，收取巨噬細(xì)胞THP1提取細(xì)胞總蛋白，Westernblot檢測細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子STAT3、磷酸化STAT3的活性。
　　結(jié)果:
　　1、成功構(gòu)建真

10、核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1-NS2，經(jīng)HindⅢ、BamHⅠ雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳鑒定有約650bp大小片段存在，測序結(jié)果顯示與Genbank記載序列一致。
　　2、獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的單克隆細(xì)胞L02(pEGFP-C1-vector)和L02(pEGFP-C1-NS2)。經(jīng)PCR檢測L02(pEGFP-C1-NS2)組中有目的基因GFP-NS2的表達(dá)，Westernblot檢測結(jié)果顯示有GFP-NS2融合蛋白的表達(dá)。
　

11、　3、L02細(xì)胞增殖曲線顯示，L02細(xì)胞組、L02(pEGFP-C1-vector)細(xì)胞組和L02(pEGFP-C1-NS2)細(xì)胞組，三組細(xì)胞之間增殖水平無差別(P＞0.05)。
　　4、L02細(xì)胞Real-timePCR結(jié)果顯示:L02(pEGFP-C1-NS2)細(xì)胞組抑炎因子IL-10、TGF-βmRNA水平較L02細(xì)胞組和L02(pEGFP-C1-vector)細(xì)胞組升高（P＜0.05）;與L02組比較，L02(pEGFP-

12、C1-vector)細(xì)胞組和L02(pEGFP-C1-NS2)細(xì)胞組促炎因子IL-8mRNA表達(dá)水平降低，但轉(zhuǎn)質(zhì)粒兩組間無差異(P＞0.05)。
　　5、THP1細(xì)胞Real-timePCR結(jié)果顯示，與L02(pEGFP-C1-NS2)共培養(yǎng)6h后THP1細(xì)胞中細(xì)胞因子IL-1β、IL-8、TGF-βmRNA水平高于其他三個對照組(P＜0.05)細(xì)胞因子IL-10在四組之間無差異(P＞0.05);而在共培養(yǎng)10h后，與L02(pE

13、GFP-C1-NS2)共培養(yǎng)的THP1細(xì)胞中IL-10mRNA水平高于其他三個對照組，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　6、CBA結(jié)果顯示，THP1與L02(pEGFP-C1-NS2)共培養(yǎng)12h、24h后其上清中細(xì)胞因子IL-6、IL-1β、TNF、IL-10均顯著高于其他三個對照組（P＜0.05）。
　　7、L02、L02(pEGFP-C1-vector)、L02(pEGFP-C1-NS2)三種細(xì)胞，與巨噬細(xì)胞THP1

14、共培養(yǎng)12h、24h后，提取巨噬細(xì)胞THP1蛋白，westernblot顯示STAT3總量及磷酸化STAT3表達(dá)無明顯改變。
　　結(jié)論:
　　1、成功構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1-NS2，并獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的單克隆細(xì)胞L02(pEGFP-C1-vector)和L02(pEGFP-C1-NS2)。
　　2、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HCVNS2的L02細(xì)胞抑炎因子IL-10和TGF-βmRNA表達(dá)增高。
　　3、與轉(zhuǎn)染HCV