荔枝果皮花色素苷生物合成關(guān)鍵調(diào)控因子的篩選及其功能驗(yàn)證.pdf

1、荔枝（Litchi chinensis Sonn.）是我國南方重要的亞熱帶果樹，種質(zhì)資源豐富，果實(shí)色澤類型多樣，但荔枝果實(shí)色澤生物合成的機(jī)理尚不清楚。荔枝果實(shí)的著色是花色素苷積累的結(jié)果，模式植物中的研究發(fā)現(xiàn)花色素苷的生物合成調(diào)控主要在轉(zhuǎn)錄水平，MYB-bHLH-WD40蛋白復(fù)合體調(diào)控著花色素苷生物合成途徑。本文基于轉(zhuǎn)錄組和基因組數(shù)據(jù)庫獲得了可能參與荔枝花色素苷生物合成調(diào)控的MYB和bHLH轉(zhuǎn)錄因子，探討了MYB和bHLH轉(zhuǎn)錄因子如何調(diào)控

2、花色素苷生物合成途徑，研究結(jié)果為揭示荔枝果皮花色素苷生物合成和調(diào)控的分子機(jī)制提供了理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下：
　　1、通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草遺傳轉(zhuǎn)化研究了LcMYB1轉(zhuǎn)錄因子的功能，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)LcMYB1的煙草葉片和花梗積累花色素苷，而野生型煙草葉片和花梗不積累花色素苷。轉(zhuǎn)基因煙草的花瓣中花色素苷含量的是野生型的3-4倍。煙草內(nèi)源的bHLH轉(zhuǎn)錄因子NtAn1a和NtAn1b的表達(dá)在轉(zhuǎn)基因煙草葉片和花梗中明顯上調(diào)表達(dá)，這可能是葉片

3、和花梗能合成花色素苷的重要原因。另外，煙草葉片中的NtDFR、NtANS和NtUFGT基因也顯著上調(diào)表達(dá)，這些基因可能是LcMYB1轉(zhuǎn)錄因子的靶基因。
　　2、對(duì)荔枝果皮樣品進(jìn)行了RNA-seq測(cè)序，一共得到了4.6 G的原始數(shù)據(jù)，經(jīng)過組裝得到了51,089條Unigenes，這些Unigenes的平均長度為737 bp。大約70％（34,705）的基因序列可以通過比對(duì)公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能注釋。此外，還對(duì)綠、黃和紅果皮階段的樣品分別

4、進(jìn)行了數(shù)字表達(dá)譜測(cè)序。分析發(fā)現(xiàn)3,649個(gè)基因在發(fā)育過程中顯著差異表達(dá)，其中156個(gè)基因在三個(gè)階段中均顯著差異表達(dá)。在荔枝果皮轉(zhuǎn)錄組中鑒定到了葉綠素降解和類黃酮合成的關(guān)鍵基因，其中SGR基因在荔枝果皮葉綠素降解過程中起著關(guān)鍵的作用。大多數(shù)花色素苷生物合成的結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)都隨著果皮發(fā)育上升。通過比對(duì)鑒定發(fā)現(xiàn)了荔枝果皮中有53個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子，預(yù)測(cè)了10個(gè)可能參與荔枝果皮類黃酮生物合成調(diào)控的MYB轉(zhuǎn)錄因子。
　　3、在荔枝果皮轉(zhuǎn)錄組數(shù)

5、據(jù)庫中，發(fā)現(xiàn)了三個(gè)可能參與花色素苷生物合成調(diào)控的bHLH轉(zhuǎn)錄因子LcbHLH1、LcbHLH2和LcbHLH3。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)這個(gè)三個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子與其它植物中調(diào)控花色素生物合成的bHLH轉(zhuǎn)錄因子聚在一起。LcbHLH3只定位于細(xì)胞核，LcbHLH2定位于細(xì)胞質(zhì)，LcbHLH1則定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)。LcbHLH1和LcbHLH3都能在細(xì)胞核中與LcMYB1相互作用。盡管三個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)與荔枝各個(gè)組織中的花色素苷含量無相

6、關(guān)性，但LcbHLH1或LcbHLH3與LcMYB1同時(shí)在煙草葉片中瞬時(shí)表達(dá)均比單獨(dú)瞬時(shí)表達(dá)LcMYB1積累更多的花色素苷，特別是LcbHLH3。過表達(dá)LcMYB1的煙草與過表達(dá)LcbHLH3的煙草雜交后得到了同時(shí)超表達(dá)兩個(gè)基因的煙草株系，該煙草株系葉片能積累大量的花色素苷，而單獨(dú)過表達(dá)LcMYB1的煙草葉片只能積累少量花色素苷，單獨(dú)過表達(dá)LcbHLH3時(shí)煙草葉片則不能積累花色素苷。共表達(dá)轉(zhuǎn)基因煙草株系葉片中內(nèi)源的bHLH轉(zhuǎn)錄因子NtA

7、N1a和NtAN1b的表達(dá)顯著上調(diào)，結(jié)構(gòu)基因NtDFR和NtANS也顯著上調(diào)表達(dá)。雙熒光報(bào)告實(shí)驗(yàn)表明，與單獨(dú)表達(dá)LcMYB1相比，LcMYB1-LcbHLH1或者LcMYB1-LcbHLH3同時(shí)表達(dá)能強(qiáng)烈激活LcANS的啟動(dòng)子活力，對(duì)LcDFR啟動(dòng)子活性也有一定的促進(jìn)作用。綜上所述，LcbHLH1和LcbHLH3是LcMYB1必要的相互作用因子，它們相互作用形成復(fù)合體調(diào)節(jié)花色素苷生物合成結(jié)構(gòu)基因DFR和ANS的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)花色素苷的生

8、物合成。
　　4、在荔枝轉(zhuǎn)錄組中還發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)可能與花色素苷生物合成調(diào)控相關(guān)的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子LcMYB5和LcMYB2。LcMYB5在荔枝各個(gè)組織中均有表達(dá)且在荔枝果皮發(fā)育過程中表達(dá)變化不大。過表達(dá)LcMYB5煙草花瓣和子房中的花色素苷含量顯著高于野生型，同時(shí)內(nèi)源的結(jié)構(gòu)基因NtCHI、NtF3H、NtDFR和bHLH調(diào)控基因NtAN1a和NtAN1b表達(dá)上調(diào)。轉(zhuǎn)LcMYB5煙草的花瓣、花絲、花藥和子房積累了大量的花色素苷，

9、其中花瓣中花色素苷的含量是野生型花瓣4-5倍。LcMYB5定位于細(xì)胞核，能與花色素苷生物合成調(diào)控的LcbHLH1轉(zhuǎn)錄因子相互作用。雙報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證明 LcMYB5可以激活花色素苷生物合成結(jié)構(gòu)基因 F3H和 DFR的啟動(dòng)子，推測(cè)LcMYB5與LcbHLH1轉(zhuǎn)錄因子互作，通過調(diào)控花色素苷生物合成結(jié)構(gòu)基因啟動(dòng)子的活力調(diào)控花色素苷的生物合成。LcMYB5不僅參與了花色素苷的生物合成途徑，還參與了其它的一些生物過程，如轉(zhuǎn)LcMYB5的煙草花瓣及葉

10、片的pH值降低，花瓣變大。
　　5、LcMYB2與VvMYB5亞族聚在一起，它在荔枝的各個(gè)組織中均有表達(dá)，在荔枝果皮發(fā)育的早期表達(dá)量高。LcMYB2在果皮發(fā)育中的表達(dá)模式與原花青素生物合成的關(guān)鍵基因LcLAR和LcANR的表達(dá)一致。LcMYB2定位于細(xì)胞核，能與LcbHLH3相互作用。雙熒光報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示LcMYB2與LcbHLH3相互作用能激活原花青素生物合成基因LcLAR和LcANR的啟動(dòng)子。推測(cè)LcMYB2參與調(diào)控荔枝果皮中原