黑米花色素苷對(duì)機(jī)體免疫生化功能影響的研究.pdf

1、目的： 制備具有藥理活性的黑米花色素苷并分離純化其主要的活性部分，通過(guò)作用于細(xì)胞、動(dòng)物模型測(cè)定一系列的免疫和生化功能指標(biāo)，揭示其改善機(jī)體營(yíng)養(yǎng)狀況、抗氧化、增強(qiáng)免疫功能的作用，從整體和分子水平上探討其抗氧化、促免疫和抗腫瘤的作用機(jī)制。 方法： 1.酸化乙醇法提取黑米色素，再聯(lián)用樹(shù)脂柱、凝膠柱層析分離純化花色素苷，并通過(guò)薄層層析、紫外可見(jiàn)光譜分析、高效液相色譜和質(zhì)譜分析鑒定純度和結(jié)構(gòu)。 2.大鼠隨機(jī)分為4組，

2、每組以不同劑量的花色素苷，連續(xù)給藥30 d。從大鼠股動(dòng)脈取血，在全自動(dòng)生化分析儀上測(cè)定血液主要生化指標(biāo)。稱(chēng)胸腺、脾、肝和腎濕重，并計(jì)算其濕重指數(shù)；生化方法測(cè)定胸腺、脾、肝、腎和巨噬細(xì)胞內(nèi)乳酸脫氫酶(LDH)、酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和(或)還原型谷胱甘肽(GSH)的活力，并進(jìn)一步觀察巨噬細(xì)胞攝取中性紅的能力。 3.用CCK-8試劑盒檢測(cè)花色素苷對(duì)小鼠脾細(xì)胞的增殖作用，

3、硝酸鹽還原酶法檢測(cè)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞一氧化氮(NO)的生成量，熒光法檢測(cè)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞一氧化氮合酶(iNOS)的活性，RT-PCR檢測(cè)iNOS mRNA的表達(dá)。 4.用不同濃度的花色素苷和矢車(chē)菊素-3-葡萄糖苷分別處理Hela細(xì)胞后，CCK-8法測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率；Hoechst33258染色，激光共聚焦鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)；流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率；SABC染色檢測(cè)Bax/Bcl-2的蛋白表達(dá)。 結(jié)果： 1.檢測(cè)黑米花色

4、素苷的純度為37.69％，并鑒定其主活性部分化合物為矢車(chē)菊素-3-葡萄糖苷。 2.花色素苷組大鼠血液中尿素氮(UN)、尿酸(UA)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TCh)、低密度脂蛋白(LDL)水平都有不同程度的降低，花色素苷組大鼠組織臟器的濕重增加(胸腺、肝)，LDH(脾、肝、腎)、ACP(胸腺、脾、肝、腎)、AKP(胸腺、肝、腎)活力、GSH(脾、肝、腎)、SOD(胸腺、脾、肝)水平顯著上升，MDA(肝、腎)的含量下降。PMO

5、內(nèi)ACP、LDH活力顯著升高。PMФ和AMФ中的SOD活力升高，降低MDA的水平，而且能顯著增強(qiáng)大鼠PMФ、AMФ的吞噬能力。 3.花色素苷可促進(jìn)脾細(xì)胞的增殖，并在一定濃度下呈劑量依賴(lài)效應(yīng)；能刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞NO的生成，提高一氧化氮合酶(NOS)的活性，其中矢車(chē)菊素-3-葡萄糖苷可以誘導(dǎo)iNOS mRNA的表達(dá)。 4.25～400 mg/L花色素苷和12.5～200μmol/L矢車(chē)菊素-3-葡萄糖苷可抑制Hela細(xì)胞

6、生長(zhǎng)，抑制率呈時(shí)間劑量依賴(lài)性；激光共聚焦鏡下可見(jiàn)到明顯的凋亡細(xì)胞；流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示可以提高凋亡率；免疫組化檢測(cè)表明Bax表達(dá)上升，Bcl-2表達(dá)下降。 結(jié)論： 1.證實(shí)黑米中花色素苷主要活性成分為矢車(chē)菊素-3-葡萄糖苷。 2.花色素苷可以降低大鼠血液主要生化指標(biāo)中尿素氮(UN)、尿酸(UA)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TCh)、低密度脂蛋白(LDL)的水平，通過(guò)調(diào)節(jié)LDH、ACP、AKP、SOD、MDA和(或

7、)GSH的活性對(duì)巨噬細(xì)胞和組織器官起保護(hù)作用，其中提高LDH、ACP的水平激活巨噬細(xì)胞活性和吞噬功能，表明花色素苷對(duì)機(jī)體具有重要的免疫調(diào)節(jié)功能。 3.花色素苷有促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞的增殖作用并通過(guò)增加一氧化氮合酶(NOS)合成，進(jìn)而刺激小鼠巨噬細(xì)胞NO的生成，其中矢車(chē)菊素-3-葡萄糖苷可以誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞iNOS mRNA轉(zhuǎn)錄。表明花色素苷具有促進(jìn)免疫的活性。 4.花色素苷與矢車(chē)菊素-3-葡萄糖苷都可抑制Hela細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)