栽培煙草原生質(zhì)體培養(yǎng)再生植株的研究和煙草抗病相關(guān)基因NtEIF4E與NtTOM3的敲除和鑒定.pdf

1、植物原生質(zhì)體是除去細胞壁僅由細胞膜包裹的裸露細胞。煙草原生質(zhì)體遺傳表達系統(tǒng)作為研究基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控、基因瞬時表達和信號通路的一種重要工具廣泛應(yīng)用，也是在細胞水平上研究植物分子機制和植物病毒感染的理想實驗材料；此外，原生質(zhì)體再生植株體系，也是實現(xiàn)單細胞遺傳操作以及加快分子育種進程的重要基礎(chǔ)。
　　煙草是一種重要的模式植物和經(jīng)濟作物。煙草抗病相關(guān)基因的研究有助于了解植物對病蟲害的防御機制，并且減少病蟲害對煙草產(chǎn)量造成的損失。馬鈴薯Y病毒（

2、Potato virus Y，PVY）和煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）是危害國內(nèi)煙草種植業(yè)的優(yōu)勢病毒，對煙草的產(chǎn)量造成嚴重的經(jīng)濟損失。病毒浸染植株時，病毒需要依賴宿主細胞提供復(fù)制和翻譯的場所以及能量的供應(yīng)，其感染過程即是病毒與植物的互作的產(chǎn)物。下調(diào)這類宿主基因即可有效的抑制相關(guān)病毒的感染和傳播。已有研究結(jié)果顯示，EIF4E和TOM3基因分別是協(xié)助PVY和TMV病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)運的關(guān)鍵基因。
　　本研究

3、以栽培煙草作為原生質(zhì)體分離、純化和再生體系構(gòu)建的材料，對相關(guān)的影響因素進行了研究，獲得了產(chǎn)量較高、質(zhì)量較好的原生質(zhì)體，并獲得了栽培煙草再生植株。另一方面，使用Crispr/Cas9敲除系統(tǒng)敲除NtEIF4E和NtTOM3基因，獲得了轉(zhuǎn)基因植株，為研究栽培煙草抵抗PVY和TMV病毒的感染奠定了基礎(chǔ)。本研究的主要結(jié)果如下：
　　1.栽培煙草原生質(zhì)體的分離和純化
　　構(gòu)建了栽培煙草紅花大金元原生質(zhì)體分離純化系統(tǒng)。使用纖維素酶和離析

4、酶酶解八周左右煙草無菌幼苗的細胞壁，去除葉尖和葉脈組織后將葉片切成1-2厘米的絲狀，與酶液混合恒溫培養(yǎng)12小時。去除殘余物質(zhì)后多次離心后即可得到純凈的原生質(zhì)體。
　　2.栽培煙草原生質(zhì)體再生體系的構(gòu)建
　　成功構(gòu)建了紅花大金元原生質(zhì)體再生體系。主要探究了pH值和甘露醇濃度對煙草原生質(zhì)體分裂的影響，發(fā)現(xiàn)在pH5.8和0.5M甘露醇條件下，煙草原生質(zhì)體分裂效果最佳。從原生質(zhì)體到完整植株所需培養(yǎng)時間為200天左右。
　　3.

5、栽培煙草原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和檢測
　　使用PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化煙草原生質(zhì)體。我們發(fā)現(xiàn)Sigma公司生產(chǎn)的PEG4000最適合用于栽培煙草紅花大金元的轉(zhuǎn)化。同時，我們也發(fā)現(xiàn)小片段的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率高于大片段的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化所需時間也低于大片段質(zhì)粒。
　　4.煙草NtEIF4E和NtTOM3敲除載體構(gòu)建和突變檢測
　　由于實驗室已建立成熟的CRISPR/CAS9基因敲除系統(tǒng)，我們成功的構(gòu)建了紅花大金元抗煙草花葉病毒相關(guān)基因NtTOM

6、3和K326抗馬鈴薯Y病毒相關(guān)基因NtEIF4E的CRISPR/CAS9敲除載體9個，經(jīng)檢測，基因敲除呈陽性，并最終獲得了轉(zhuǎn)基因植株7株。NtEIF4E敲除植株中發(fā)現(xiàn)三個靶位點產(chǎn)生突變，三個靶位點檢測的突變形式各有差異，靶位點1主要為增加一個堿基A，靶位點2主要為單個堿基的突變，靶位點3則主要為刪除一個堿基G；NtTOM3敲除植株僅檢測到一個靶位點產(chǎn)生突變，主要形式為堿基的刪除，檢測到的刪除形式主要為在距離PAM前面6個堿基中刪除一個至