甘蔗鞭黑粉菌有性配合相關(guān)基因SsGpa的功能分析.pdf

1、甘蔗鞭黑粉菌[Sporisorium scitamineum(Syd.) M.Piepenber，M.Stoll&F. Oberw]引起的黑穗病是甘蔗上一種世界性的病害，嚴重影響甘蔗的質(zhì)量和產(chǎn)量。目前對于甘蔗鞭黑粉菌有性配合的分子機制知之甚少，從基因水平研究該菌的有性配合機理，將可為發(fā)展新的防治策略提供理論依據(jù)。本實驗室前期研究自甘蔗鞭黑粉菌單倍體菌株WT18篩選到一株有性配合能力明顯減弱的T-DNA插入突變體菌株A9，獲得了其插入位點

2、的側(cè)翼序列。為了進一步明確因插入而引起突變的該基因及其在有性配合過程中的功能，本研究預(yù)測了該基因結(jié)構(gòu)，并通過基因敲除、功能互補及其表型及致病性等對該基因功能進行了分析，主要結(jié)果如下：
　　1.分析了突變體 A9被 T-DNA插入破壞的基因結(jié)構(gòu)。生物信息學(xué)分析表明被T-DNA破壞的基因全長1365 bp，含有一個29 bp的內(nèi)含子，編碼454個氨基酸；所編碼的蛋白含有一個G-Patch保守結(jié)構(gòu)域，擬命名該基因為SsGpa；蛋白比對顯

3、示該基因與玉米絲軸黑粉菌（Sporisorium reilianum）和玉米黑粉菌（Ustilago maydis）的uncharacterized protein基因分別有66％的同源性和57%同源性。
　　2.獲得了用于研究基因SsGpa功能的敲除突變體和功能互補體。根據(jù)基因SsGpa序列及上、下游序列設(shè)計了3對特異性引物，分別構(gòu)建了基于基因SsGpa的敲除載體和功能互補載體，采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化進行了基因敲除和功能互

4、補；通過PCR檢測、Southern雜交篩選、實時熒光定量PCR分析，表明原突變體菌株A9所突變的基因為SsGpa。
　　3.基因SsGpa影響甘蔗鞭黑粉菌有性配合，而不影響其生長。與野生型對應(yīng)性系WT17的有性配合結(jié)果顯示，突變體A9和敲除突變體?SsGpa有性配合能力明顯減弱，只能在菌落邊緣長出微弱的菌絲，而互補體SsGpa-c恢復(fù)到野生型WT18的水平；顯微觀察和生長速率測定結(jié)果表明，?SsGpa、SsGpa-c、WT17和

5、 WT18形態(tài)上沒有差異，生長速率基本一致。
　　4.轉(zhuǎn)錄組分析顯示基因 SsGpa影響甘蔗鞭黑粉菌有性配合過程的信息素調(diào)控因子基因(prf1)的表達a位點和b位點通過Prf1作為轉(zhuǎn)錄激活因子激活，信息素合成基因(mfa)和基因bEast(bE)表達量顯著下調(diào)。實時熒光定量PCR檢測了mfa和pra在野生型和突變體中的表達量，結(jié)果顯示 mfa在?SsGpa中表達量明顯低于野生型，而SsGpa-c表達量恢復(fù)到接近野生型的表達量，pr

6、a在野生型和突變體中的表達沒有變化，表明基因SsGpa影響了基因mfa的表達，進而影響了甘蔗鞭黑粉菌的信息素的合成，導(dǎo)致不能進行有性配合。
　　5.基因SsGpa的突變可顯著影響甘蔗鞭黑粉菌的致病能力。致病力測定結(jié)果顯示?SsGpa與WT17混合的致病力極弱，發(fā)病率為3.33%；SsGpa-c與WT17混合接種甘蔗的發(fā)病率接近野生型，發(fā)病率為73.33%。
　　以上結(jié)果表明甘蔗鞭黑粉菌基因SsGpa與有性配合密切相關(guān)，其作用