成人急非淋M-,2-型患者AML1-ETO mRNA表達(dá)與臨床意義及其scFv單鏈抗體文庫構(gòu)建的初步研究.pdf

1、t(8；21)(q22；q22)染色體易位形成的AML1/ETO (AE)融合基因編碼產(chǎn)物是一種多功能蛋白質(zhì)，可通過影響細(xì)胞內(nèi)許多信號傳導(dǎo)系統(tǒng)和靶分子而參與細(xì)胞的分化與增值，細(xì)胞凋亡以及自我更新等過程。因此,AE融合蛋白被認(rèn)為是引起t(8；21)(q22；q22)染色體易位陽性的成人急性非淋巴細(xì)胞性白血病(ANLL)即急非淋，特別是ANLL-M<,2>型患者發(fā)病的關(guān)鍵因素，也是靶向治療該類患者一個(gè)潛在的靶分子，而高效、特異性靶向傳遞藥物

2、抑制或干擾AE的表達(dá)是靶向治療AE融合基因表達(dá)陽性患者的關(guān)鍵。 近期發(fā)現(xiàn)，單鏈抗體可變區(qū)片段(scFv)即單鏈抗體能夠高效、特異性傳遞藥物到達(dá)靶細(xì)胞。為此，本研究在分析了AE融合基因mRNA在ANLL-M<,2>型患者中的表達(dá)及其臨床意義的基礎(chǔ)上進(jìn)一步初步構(gòu)建了AE融合基因表達(dá)陽性患者的scFv單鏈抗體文庫。 第一章 ANLL-M2型患者AE基因mRNA表達(dá)及其臨床意義 目的：分析ANLL-M2型患者AE融合

3、基因的表達(dá)，并探討其與臨床表現(xiàn)，療效的關(guān)系以及在預(yù)后判斷中的意義。 方法：采用巢式逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)分析ANLL-M<,2>患者AE融合基因mRNA表達(dá)，根據(jù)AE融合基因表達(dá)結(jié)果將患者分成 AE 融合基因表達(dá)陽性組(A)和AE融合基因表達(dá)陰性組(B)。然后，對兩組患者的臨床癥狀，體征，白細(xì)胞計(jì)數(shù)及骨髓原始細(xì)胞數(shù)等進(jìn)行比較分析，并比較其治療緩解率。通過8個(gè)月隨訪，評價(jià)其在預(yù)后判斷中的意義。 結(jié)果：在2

4、3例 ANLL-M<,2>患者中，12例可檢測到AE融合基因mRNA表達(dá)，占所檢測患者的52.2％。其中，11例為M<,2a>，1例為M<,2b>。與AE融合基因mRNA表達(dá)陰性患者比較，AE融合基因mRNA表達(dá)陽性患者平均年齡較輕，外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)較低，臨床上易出現(xiàn)發(fā)熱，出血。經(jīng)治療后，AE融合基因mRNA表達(dá)陽性患者緩解率為75％，而AE融合基因mRNA表達(dá)陰性患者為36％。經(jīng)8個(gè)月隨訪發(fā)現(xiàn)，1例AE融合基因mRNA表達(dá)陰性患者在緩

5、解后第4個(gè)月復(fù)發(fā)并出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病而死亡，另1例在緩解后第7個(gè)月復(fù)發(fā)，而AE融合基因mRNA陽性患者在8個(gè)月隨訪中無復(fù)發(fā)。 結(jié)論：在ANLL-M<,2>患者中50％左右表達(dá)AE融合基因mRNA，AE融合基因mRNA表達(dá)陽性患者更易出現(xiàn)發(fā)熱，出血傾向，但是他們的治療效果較好，預(yù)后良好。 第二章 AE基因表達(dá)陽性患者scFv單鏈抗體文庫構(gòu)建的初步研究 目的：構(gòu)建AE融合基因mRNA表達(dá)陽性患者scFv單鏈抗體文

6、庫。 方法：通過RT-PCR 分別擴(kuò)增全套AE融合基因mRNA表達(dá)陽性患者重鏈(VH)和輕鏈(VL)可變區(qū)基因，切膠回收目的片段，用連接肽(Linker)將VH、VL連接成VH-Linker和VL-Linker。 結(jié)果：通過67種PCR擴(kuò)增，從 AE 融合基因mRNA陽性M<,2>型患者骨髓淋巴細(xì)胞中擴(kuò)增出全套人抗體重鏈(VH)和輕鏈(VL)可變區(qū)基因并得到6種VH家族基因，11種VL家族基因(5種Vκ和6種VX)。同時(shí)