肝細胞凋亡與氧應(yīng)激在實驗性脂肪性肝病中的作用研究.pdf

1、目的：本實驗旨在研究(1)在實驗性脂肪性肝病中肝細胞凋亡和氧應(yīng)激的作用以及相互關(guān)系，并探討其可能的機制。(2)研究高脂和酒精兩種不同的病因?qū)Ω闻K的影響以及兩者是否對肝臟有協(xié)同損傷作用，從而進一步探討脂肪性肝病的發(fā)病機制。 材料與方法： 雄性Wistar大鼠46只，按體重分層隨機分為4組：對照組(N)11只，酒精組(A)12只，高脂組(F)11只，高脂加酒精組(FA)12只。酒精組應(yīng)用酒精灌胃，高脂組給予高脂飲食，酒精加高

2、脂組為兩者的疊加，對照組應(yīng)用與酒精等量的生理鹽水灌胃。每周稱取大鼠體重，于16周末處死，稱其體重，肝濕重；取血測血清中ALT、AST、CHO、TG、FFA、；取肝組織測定肝組織中SOD、MDA、GSH；取肝組織采用RT-PCR法測定肝組織中caspase-3的基因表達；取肝組織福爾馬林固定免疫組化法測定caspase-3的蛋白表達；TUNEL法測定肝細胞凋亡指數(shù)；HE染色，光鏡下觀測肝組織學變化；電鏡下觀察肝細胞凋亡情況。 結(jié)果

3、： 1．大鼠體重及肝臟指數(shù)變化： F組大鼠體重明顯高于其他各組(P<0.05)，其次是A、N、FA組，但后三組比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。肝指數(shù)比較，各實驗組均比N組不同程度的升高(P<0.05)，以FA組最高，其次是F組、A組，而F組和A組間差異無顯著性(P>0.05)。 2．肝臟組織學改變： 光鏡下H-E染色顯示，N組大鼠肝小葉完整，肝細胞呈多邊形，圍繞中央靜脈呈放射狀，肝竇清晰可見，肝索排列整

4、齊，肝小葉匯管區(qū)基本結(jié)構(gòu)清晰可見。實驗組大鼠肝臟輕至中重度脂肪變，伴肝細胞氣球樣變，點灶狀壞死，匯管區(qū)輕至中度炎細胞浸潤，其中以FA組和F組脂肪變最嚴重，F(xiàn)A組炎癥壞死最重，和其他各組相比有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，可以看到多處灶狀壞死和碎屑樣壞死，匯管區(qū)輕度纖維化。 3．血清生化指標的變化： 實驗組ALT、AST均比N組高，且差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，以FA組最高，依次為F組、A組，但F組和A組比較差異無統(tǒng)計

5、學意義(P>0.05)，其余各組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 4．各組血脂及血清游離脂肪酸的結(jié)果： 實驗組大鼠體內(nèi)血脂均有不同程度的升高，以FA組升高最顯著，其次是F組、A組。其中CHO在各組中兩兩比較均有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；TG在FA組與F組比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，其余各組兩兩比較均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；FFA在A組與N組間，F(xiàn)組與FA組間比較差異無顯著性外(P>0.05)，在其余

6、各組兩兩比較均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 5．各組肝組織勻漿氧化應(yīng)激指標測定結(jié)果： GSH、SOD在實驗組均有不同程度的降低，以FA組最為明顯，其次是F組和A組，除F組和A組間差別無統(tǒng)計學意義外(P>0.05)，其余各組比較差別均有顯著性(P<0.05)；MDA中實驗組均有不同程度的升高，以FA組最為明顯，其次是A組、F組，除F組與A組間無統(tǒng)計學意義外(P>0.05)，其余各組差別均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

7、 6．各組肝細胞凋亡指數(shù)的測定結(jié)果各實驗組大鼠肝細胞凋亡指數(shù)明顯增加(酒精組、高脂組、酒精加高脂組分別2.16±0.43，2.33±0.60，3.93±0.80)顯著高于正常對照組(1.07±0.27，P<0.05)，實驗組凋亡細胞多見于中央靜脈周圍的小葉3區(qū)，在其它部位偶可見到，在炎癥、壞死明顯的區(qū)域凋亡較明顯，以FA組凋亡最明顯，然后是F組和A組除F組和A組間差別無統(tǒng)計學意義外(P>0.05)，其余各組比較差別均有顯著性(P<0

8、.05)，凋亡指數(shù)和炎癥程度,MDA含量呈正相關(guān)(P<0.05)，與GSH、SOD呈負相關(guān)(P<0.05)。 7．各組easpase-3的蛋白表達以及基因表達結(jié)果在實驗組無論是基因表達還是蛋白表達均較對照組升高(P<0.05), 其中以FA組增加最明顯，F(xiàn)組和A組之間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，除F組和A組間差別無統(tǒng)計學意義外(P>0.05)，其余各組比較差別均有顯著性(P<0.05)。 caspase-3及caspa

9、Lse-3 mRNA表達的析因分析顯示，加用與不加用酒精(A)對肝臟caspaLse-3及其基因的表達差異有顯著性意義(P=0.00)：加用與不加用高脂飲食(F)對caspase-3及其基因表達有顯著性差異(P=0.00)；F與A交互效應(yīng)顯著(P<0.05)。 8．肝組織超微病理變化：實驗組肝細胞核膜皺縮，細胞漿疏松，線粒體腫脹，線粒體嵴脫失，胞漿內(nèi)可見多少不等的脂滴，可見中性粒細胞、單核細胞等炎性細胞浸潤。 9．Cas

10、pase-3，MDA、脂肪變程度、炎癥程度相關(guān)性分析各組caspase-3與肝細胞凋亡指數(shù)呈正相關(guān)(r=0.829，P<0.01)，caspase-3表達與MDA呈顯著正相關(guān)(r=0.974，P<0.01)，而與GSH，SOD呈明顯負相關(guān)(r=-0.768，P<0.01；r=-0.948，P<0.01)，與脂肪變程度和炎癥分級呈正相關(guān)(r=0.73，0.85，P<0.05)。 結(jié)論： 1．酒精和高脂飲食兩種病因疊加加重肝