β-雙酮類抗生素復(fù)合暴露斑馬魚差異lncRNA的篩選及其功能研究.pdf

1、氟喹諾酮類抗生素(FQs)和四環(huán)素類抗生素(TCs)是兩類具有代表性的β-雙酮類抗生素(DKAs)。近幾年，DKAs已經(jīng)廣泛用于人類和動(dòng)物，特別是添加到動(dòng)物飼料中，防止動(dòng)物產(chǎn)生疾病和促進(jìn)其生長，或是在水產(chǎn)養(yǎng)殖中抑制細(xì)菌繁殖。雖然大多數(shù)DKAs的半衰期都比較短，但是由于在人類活動(dòng)中被頻繁、大劑量的使用，使得DKAs在環(huán)境中出現(xiàn)“假持久”的現(xiàn)象。體內(nèi)和體外一些實(shí)驗(yàn)證實(shí)，某些抗生素長期作用對生物具有內(nèi)分泌干擾性和雌激素效應(yīng)，導(dǎo)致免疫毒性、雌性

2、化、生殖失敗、流產(chǎn)等。但是，很少有研究去探究其分子致毒機(jī)理。因此我們利用高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，從分子層面探討DKAs的致毒效應(yīng)及機(jī)理，以及借助熒光定量PCR和原位雜交的方法進(jìn)一步得到驗(yàn)證。
　　目的：
　　本研究通過不同處理組（對照組、6.25mg/L、12.5mg/L DKAs處理組）斑馬魚RNA文庫的構(gòu)建和mRNA及l(fā)ncRNA高通量測序技術(shù)，鑒定斑馬魚在正常養(yǎng)殖條件下和不同濃度的DKAs暴露下的lncRNA，以及這些l

3、ncRNA及其靶基因的表達(dá)豐度在DKAs暴露下是否存在顯著性差異。并通過熒光定量PCR和原位雜交技術(shù)來驗(yàn)證lncRNA的表達(dá)及其顯著差異性變化，尋找一批斑馬魚與DKAs暴露相關(guān)的lncRNA。通過生物信息學(xué)預(yù)測lncRNA的靶基因，再與mRNA高通量測序結(jié)果相結(jié)合，篩選出在DKAs處理下差異表達(dá)的lncRNA的靶基岡，并通過qRT-PCR去驗(yàn)證。接下來我們根據(jù)lncRNA差異表達(dá)靶基因的功能，進(jìn)一步探究DKAs對斑馬魚的毒性。
　

4、　方法：
　　1.以模式生物斑馬魚（Danio rerio）為實(shí)驗(yàn)材料，選取六種廣泛使用的β-雙酮類抗生素:三種氟喹諾酮類抗生素（環(huán)丙沙星、氧氟沙星及恩諾沙星）、三種四環(huán)素類抗生素（鹽酸強(qiáng)力霉素、鹽酸金霉素及土霉素）作為實(shí)驗(yàn)藥物，建立斑馬魚DKAs復(fù)合暴毒品系。
　　2.構(gòu)建對照組、6.25mg/L、12.5mg/L三組斑馬魚相應(yīng)的RNA文庫，本實(shí)驗(yàn)測定了對照組、兩個(gè)DKAs處理組3月齡斑馬魚的整體轉(zhuǎn)錄組，通過Illumin

5、a系統(tǒng)的高通量測序得到大量lncRNA，經(jīng)過數(shù)據(jù)的挖掘和篩選于lncRNA數(shù)據(jù)中篩選出一批符合標(biāo)準(zhǔn)的lncRNAs。
　　3.以差異倍數(shù)≥2，p-value≤0.05，表達(dá)豐度≥50為條件，篩選不同DKAs暴露下表達(dá)豐度均有顯著差異的lncRNA，然后通過lncRNA與mRNA的位置關(guān)系或lncRNA與mRNA序列之間形成二級結(jié)構(gòu)所需自由能的大小預(yù)測差異表達(dá)lncRNA的靶基因，并根據(jù)差異倍數(shù)≥2，p-value≤0.05篩選出差

6、異表達(dá)的靶基因。
　　4.對篩選出來的差異表達(dá)的lncRNA和靶基因設(shè)計(jì)熒光定量PCR的特異性引物，利用SYBR Green定量PCR驗(yàn)證三組中l(wèi)ncRNA以及靶基因的差異表達(dá)。
　　5.合成篩選出的差異表達(dá)的lncRNA探針，通過原位雜交技術(shù)來探究其在組織脾臟和肝臟中的表達(dá)特異性以及差異。
　　6.通過對差異表達(dá)lncRNA靶基因分析探究差異表達(dá)lncRNA主要功能，進(jìn)一步探究DKAs對該功能的毒性。
　　結(jié)果

7、：
　　1.斑馬魚三個(gè)樣本提取的總RNA質(zhì)量均滿足OD260/OD280＞1.8，表示可以用于后續(xù)測序分析。
　　2.高通量測序?qū)φ战M、6.25mg/L和12.5mg/L處理組分別獲取71，532，662、65，426，852、84，020，924條raw reads。經(jīng)過篩選和過濾，共預(yù)測出54，153條lncRNA符合lncRNA篩選條件。
　　3.根據(jù)差異表達(dá)lncRNA篩選條件6.25mg/L處理組與對照組相比

8、我們篩選出44個(gè)lncRNA基因差異表達(dá)，12.5mg/L處理組與對照組相比，有39個(gè)差異表達(dá)lncRNA基因。其中，有10條lncRNA在6.25mg/L處理組和12.5mg/L處理組與對照組相比表達(dá)都有差異。
　　4.qRT-PCR檢測對照組、6.25mg/L處理組和12.5mg/L處理組三個(gè)樣品中大部分差異表達(dá)的lncRNA和靶基因的轉(zhuǎn)錄水平，并與對應(yīng)的高通量測序結(jié)果表達(dá)變化趨勢進(jìn)行比較，qRT-PCR結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一

9、致，證明轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果可靠。
　　5.合成DIG標(biāo)記的lncRNA探針，通過原位雜交技術(shù)來進(jìn)一步驗(yàn)證篩選的lncRNA在對照組、6.25mg/L和12.5mg/L處理組中不同組織中的分布及表達(dá)情況。結(jié)果表明篩選的三條與免疫功能相關(guān)的lncRNA中TCONS_00129029和TCONS_00027240在肝臟和脾臟中表達(dá)均受到DKAs的抑制，TCONS_00017790在肝臟和脾臟中表達(dá)量升高。
　　6.我們進(jìn)一步對三個(gè)濃度

10、DKAs處理對斑馬魚的免疫毒性進(jìn)行研究，我們研究了與免疫相關(guān)的生物標(biāo)志物，免疫器官的病理切片及透射電鏡。
　　(1)β-雙酮類藥物對補(bǔ)體C3、IgM、內(nèi)臟團(tuán)和腦部的溶菌酶含量以及堿性磷酸酶活性均造成不同程度的影響，其中腦中溶菌酶和血液中補(bǔ)體C3含量均在DKAs處理后下降，堿性磷酸酶、IgM和內(nèi)臟團(tuán)中溶菌酶含量在DKAs低濃度處理表達(dá)量升高，高濃度處理下降。
　　(2)對斑馬魚的免疫器官脾臟、小腸的HE病理切片顯示DKAs導(dǎo)致

11、斑馬魚小腸肌肉層溶解、杯狀細(xì)胞數(shù)量增加，脾臟組織中棕色異染顆粒增多、細(xì)胞分布不均。
　　(3)在透射電鏡下我們可以進(jìn)一步觀察到DKAs藥物濃度處理造成小腸柱狀上皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞線粒體空泡化，肥大細(xì)胞水腫，上皮細(xì)胞變形和凋亡。
　　(4)透射電鏡下對照組鰓絲清晰可見血道、扁平上皮細(xì)胞與支持細(xì)胞，支持細(xì)胞細(xì)胞核明顯可見，充盈整個(gè)胞體中，且染色質(zhì)分布均勻，扁平上皮細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻，且與支持細(xì)胞之間竇狀隙明顯可見，

12、而三個(gè)藥物處理組中細(xì)胞與細(xì)胞之間界限不清晰，上皮細(xì)胞脫落，血管中紅細(xì)胞溶解，支持細(xì)胞細(xì)胞核固縮，其中12.5和50mg/L處理組支持細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)發(fā)生嚴(yán)重腫脹溶解。
　　結(jié)論：
　　利用新一代高通量測序技術(shù)對β-雙酮類抗生素長期暴露的斑馬魚成魚進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組和lncRNA測序，篩選出一批顯著差異表達(dá)的基因和lncRNAs。運(yùn)用生物信息學(xué)方法對差異表達(dá)lncRNA的作用靶基因進(jìn)行KOG功能注釋及涉及的代謝通路KEGG Pathway富

13、集分析，構(gòu)建了lncRNA與作用靶基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。針對調(diào)控免疫功能相關(guān)靶基因的差異lncRNA，通過qRT-PCR、原位雜交技術(shù)驗(yàn)證了藥物暴露下在肝臟和脾臟中的異常變化，同時(shí)從免疫相關(guān)標(biāo)志物的變化、免疫器官病理組織損傷以及透射電鏡的觀察佐證了β-雙酮類抗生素低劑量長期暴露對斑馬魚免疫系統(tǒng)的致毒效應(yīng)。
　　總之，我們的研究表明在DKAs長期慢性暴毒情況下會(huì)導(dǎo)致斑馬魚體內(nèi)部分與免疫功能相關(guān)的lncRNA及其靶基因的差異表達(dá)，生理指標(biāo)的