AT1R自身抗體介導(dǎo)血管性排斥反應(yīng)的作用機制研究.pdf

1、腎臟移植是臨床根治慢性終末期腎病的有效方法，隨著配型技術(shù)和免疫抑制劑的進步，移植后急性排斥反應(yīng)發(fā)生率降低，短期存活率大幅提高。但是移植后發(fā)生一定比例的急性排斥反應(yīng)(acute rejection，AR)仍然是腎移植術(shù)后的主要并發(fā)癥之一，也是導(dǎo)致慢性排斥反應(yīng)(chronic rejection，CR)和移植腎失功的重要危險因素。同種異體腎移植術(shù)后發(fā)生排斥反應(yīng)主要有兩種機制，一是抗體介導(dǎo)的體液免疫，二是T細胞介導(dǎo)的細胞免疫，兩種理論的根本區(qū)

2、別在于移植物的損害是由抗體的活動所造成，還是直接的細胞毒作用，即由T細胞、NK細胞等細胞毒或遲發(fā)性超敏反應(yīng)所造成的。如果受者體內(nèi)存在或出現(xiàn)針對供者特異性的抗體，通常稱為急性體液性排斥反應(yīng)(acute humoralrejection，AHR)或血管性排斥反應(yīng)，體液性排斥反應(yīng)導(dǎo)致移植物失功仍是臨床治療中的難題。2001年，第六屆Banff腎移植病理會議正式將同種異型抗體介導(dǎo)的腎移植排斥反應(yīng)的病理診斷補充入Banff國際分型標(biāo)準(zhǔn)，急性抗體介

3、導(dǎo)的移植腎排斥反應(yīng)診斷標(biāo)準(zhǔn)包括3個基本特點：急性組織損傷的形態(tài)學(xué)證據(jù)；抗體作用的免疫病理學(xué)證據(jù)(如腎小管周圍毛細血管C4d沉積)；循環(huán)供體特異性HLA抗體或其他供體內(nèi)皮細胞抗原特異性抗體的血清學(xué)證據(jù)。Colvin將抗體引起的移植物損傷進一步分為四種類型：超急性排斥反應(yīng)、急性排斥反應(yīng)、慢性排斥反應(yīng)和無臨床癥狀的適應(yīng)狀態(tài)。介導(dǎo)體液性排斥反應(yīng)的抗體多為HLA抗體，我們臨床檢測多可以避免這種排斥反應(yīng)，但那些未知抗體目前還沒有引起足夠的重視，雖然

4、發(fā)生幾率不高，但一旦發(fā)生，尚無特異治療手段。因此，鑒別這些非抗HLA抗體并闡明其作用機制，對體液排斥反應(yīng)的有效治療顯得非常重要。非HLA抗體包括抗MICA抗體、抗MICB抗體、抗內(nèi)皮細胞抗體和新近發(fā)現(xiàn)的抗血管緊張素Ⅱ1型受體自身抗體(Autoantibodies against the angiotensinII type1 receptor,AT1-AA)等。AT1-AA于1999年在先兆子癇患者中發(fā)現(xiàn)的，直到2005年Dragun等

5、才發(fā)現(xiàn)在發(fā)生頑固性血管性排斥反應(yīng)的患者中存在AT1-AA，并認(rèn)為AT1-AA在介導(dǎo)血管性排斥反應(yīng)中起重要作用。為證明AT1-AA可引起血管性排斥反應(yīng)，Dragun等將含有人AT1-AA的血清注射到腎移植大鼠。實驗使用Fischer344-Lewis腎移植模型，移植后一周，移植腎顯示動脈內(nèi)膜炎和血管內(nèi)浸潤。但該實驗采用人血清，并且不是純化的抗體，不能完全排除存在異種抗原抗體反應(yīng)的可能性，因此，我們認(rèn)為需要采用大鼠源性AT1-AA針對大鼠進

6、行實驗，才能更直接闡明AT1-AA對移植腎臟的損傷作用。Dragun等報道的16例AT1-AA引起的血管性排斥反應(yīng)患者中只有5例C4d陽性，說明其排斥進程與HLA抗體介導(dǎo)的血管性排斥反應(yīng)有所區(qū)別。我們推測AT1-AA介導(dǎo)的血管性排斥反應(yīng)機制并非如HLA抗體那樣結(jié)合細胞表面抗原后激活補體導(dǎo)致細胞的損傷，其可能的機制是與靶細胞表面的ATIR結(jié)合后啟動細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制，促進細胞的增殖或凋亡。為驗證以上假設(shè)，我們將觀察內(nèi)皮細胞(endothe

7、lial cell，EC)受到AT1-AA刺激后的功能改變，細胞間粘附分子-1(Intercellularadhesion molecule-1，ICAM-1)作為急性排斥反應(yīng)和內(nèi)皮激活的重要指標(biāo)將作為檢測對象。 體液性排斥反應(yīng)學(xué)說認(rèn)為EC是抗體作用的最初靶點。血管內(nèi)皮細胞在血液和組織液間有廣泛的聯(lián)系和物質(zhì)交換，不僅具有選擇性通透性、抗血栓性、血管緊張調(diào)節(jié)、毛細血管形成、產(chǎn)生細胞因子、粘附因子及抗腫瘤活性等功能。細胞間粘附分子-

8、1是免疫球蛋白超家族中的一員，文獻報道急性排斥反應(yīng)時，腎小管上皮細胞和腎血管內(nèi)皮細胞上ICAM-1表達明顯增加，且腎小管上皮細胞上ICAM-1的表達與排斥的嚴(yán)重性呈正相關(guān)。ICAM-1不僅是急性排斥反應(yīng)的始動因素，而且在免疫應(yīng)答和移植物的排斥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。AT1-AA是否會刺激內(nèi)皮細胞增殖，導(dǎo)致ICAM-1的合成與分泌增加從而加重或啟動血管性排斥反應(yīng)尚無相關(guān)研究報道。本實驗將用AT1-AA刺激培養(yǎng)的大鼠動脈內(nèi)皮細胞，檢測ICAM-

9、1的合成和釋放是否增加。有研究顯示，AngII與ATIR結(jié)合后是通過MAPK、JAK/STAT等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實現(xiàn)生物學(xué)功能，特別是在內(nèi)皮細胞損傷、血管平滑肌細胞增殖和動脈粥樣硬化的形成方面發(fā)揮作用。我們推測AT1-AA可能是通過與這些細胞表面的配體(ATIR)結(jié)合，轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞內(nèi)信號。本實驗將研究MAPKs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在AT1-AA介導(dǎo)內(nèi)皮細胞功能變化中的作用。 對AT1-AA進行研究必須獲得一定數(shù)量的AT1-AA，并對其進行檢測和

10、鑒定。我們擬用大鼠ATIR多肽免疫大鼠，觀察是否可誘導(dǎo)產(chǎn)生AT1-AA；將AT1-AA注射到腎移植大鼠，觀察是否引發(fā)排斥反應(yīng)，探討AT1-AA對腎血管內(nèi)皮細胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，然后選用可能的阻斷方法。通過上述研究，闡明同種AT1-AA確可介導(dǎo)早期體液性排斥反應(yīng)、缺血再灌注損傷的移植腎內(nèi)皮細胞為抗體作用的主要靶點、AT1-AA與受體結(jié)合后的主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。本課題對于揭示AT1-AA介導(dǎo)體液性排斥反應(yīng)的發(fā)生、作用機理具有重要意義，為臨床監(jiān)測

11、和治療這一特殊類型排斥反應(yīng)提供理論依據(jù)。 主要研究內(nèi)容： 1.本研究擬用大鼠源性ATIR多肽片段偶聯(lián)血藍蛋白制備抗原并免疫大鼠，監(jiān)測免疫的大鼠體內(nèi)是否產(chǎn)生AT1-AA，如有AT1-AA生成則對其進行分離、純化和鑒定，并觀察其對自身組織有無病理性損傷。 2.采用制備的大鼠源性AT1-AA注射到腎移植受體大鼠，觀察受體大鼠是否發(fā)生急性血管性排斥反應(yīng)，并重點觀察血管內(nèi)皮細胞有無損傷；給予口服氯沙坦有無保護作用。

12、 3.在體外實驗中觀察AT1-AA對培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞的作用，監(jiān)測內(nèi)皮細胞受到AT1-AA刺激后ICAM-1的表達變化。研究AT1-AA誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞ICAM-1表達的信號通路，探討AT1-AA介導(dǎo)內(nèi)皮細胞ICAM-1變化的分子機制。使用氯沙坦阻斷對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及ICAM-1合成有無影響，探討氯沙坦是否可作為臨床預(yù)防和治療AT1-AA所致排斥反應(yīng)的措施。 結(jié)論： 1.大鼠源性ATIR多肽能夠誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生ATIR自身抗體，此抗體

13、對自身組織的損傷作用不明顯。本實驗證實了大鼠源性AT1-AA的存在，并成功的對抗體進行分離、純化，為進一步研究其在器官移植中的作用提供了實驗基礎(chǔ)。 2.采用制備的大鼠源性AT1-AA注射到腎移植受體大鼠，觀察發(fā)現(xiàn)受體大鼠發(fā)生急性血管性排斥反應(yīng)，光鏡和電鏡顯示移植腎血管內(nèi)皮細胞有明顯損傷。 3.AT1-AA可引起部分難治性血管性排斥反應(yīng)，推測其可能機制是與內(nèi)皮細胞表面ATIR結(jié)合后啟動細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，造成內(nèi)皮功能紊亂，

14、表現(xiàn)之一是合成并分泌ICAM-1，進而導(dǎo)致白細胞浸潤并進一步破壞內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)和功能，形成惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致移植物失功。使用ATIR阻斷劑(如氯沙坦)可以減輕這種排斥反應(yīng)，對移植腎有益，提示臨床移植前后需要檢測受體AT1-AA水平，特別是既往妊高癥或惡性高血壓患者，治療AT1-AA引起的排斥反應(yīng)可以早期使用ARBs。 4.用AT1-AA刺激培養(yǎng)的大鼠動脈內(nèi)皮細胞，可以誘導(dǎo)IC AM-1的合成和釋放增加，AT1- AA可以活化ERK