AT1R自身抗體介導血管性排斥反應的作用機制研究.pdf

1、腎臟移植是臨床根治慢性終末期腎病的有效方法，隨著配型技術和免疫抑制劑的進步，移植后急性排斥反應發(fā)生率降低，短期存活率大幅提高。但是移植后發(fā)生一定比例的急性排斥反應(acute rejection，AR)仍然是腎移植術后的主要并發(fā)癥之一，也是導致慢性排斥反應(chronic rejection，CR)和移植腎失功的重要危險因素。同種異體腎移植術后發(fā)生排斥反應主要有兩種機制，一是抗體介導的體液免疫，二是T細胞介導的細胞免疫，兩種理論的根本區(qū)

2、別在于移植物的損害是由抗體的活動所造成，還是直接的細胞毒作用，即由T細胞、NK細胞等細胞毒或遲發(fā)性超敏反應所造成的。如果受者體內存在或出現(xiàn)針對供者特異性的抗體，通常稱為急性體液性排斥反應(acute humoralrejection，AHR)或血管性排斥反應，體液性排斥反應導致移植物失功仍是臨床治療中的難題。2001年，第六屆Banff腎移植病理會議正式將同種異型抗體介導的腎移植排斥反應的病理診斷補充入Banff國際分型標準，急性抗體介

3、導的移植腎排斥反應診斷標準包括3個基本特點：急性組織損傷的形態(tài)學證據；抗體作用的免疫病理學證據(如腎小管周圍毛細血管C4d沉積)；循環(huán)供體特異性HLA抗體或其他供體內皮細胞抗原特異性抗體的血清學證據。Colvin將抗體引起的移植物損傷進一步分為四種類型：超急性排斥反應、急性排斥反應、慢性排斥反應和無臨床癥狀的適應狀態(tài)。介導體液性排斥反應的抗體多為HLA抗體，我們臨床檢測多可以避免這種排斥反應，但那些未知抗體目前還沒有引起足夠的重視，雖然

4、發(fā)生幾率不高，但一旦發(fā)生，尚無特異治療手段。因此，鑒別這些非抗HLA抗體并闡明其作用機制，對體液排斥反應的有效治療顯得非常重要。非HLA抗體包括抗MICA抗體、抗MICB抗體、抗內皮細胞抗體和新近發(fā)現(xiàn)的抗血管緊張素Ⅱ1型受體自身抗體(Autoantibodies against the angiotensinII type1 receptor,AT1-AA)等。AT1-AA于1999年在先兆子癇患者中發(fā)現(xiàn)的，直到2005年Dragun等

5、才發(fā)現(xiàn)在發(fā)生頑固性血管性排斥反應的患者中存在AT1-AA，并認為AT1-AA在介導血管性排斥反應中起重要作用。為證明AT1-AA可引起血管性排斥反應，Dragun等將含有人AT1-AA的血清注射到腎移植大鼠。實驗使用Fischer344-Lewis腎移植模型，移植后一周，移植腎顯示動脈內膜炎和血管內浸潤。但該實驗采用人血清，并且不是純化的抗體，不能完全排除存在異種抗原抗體反應的可能性，因此，我們認為需要采用大鼠源性AT1-AA針對大鼠進

6、行實驗，才能更直接闡明AT1-AA對移植腎臟的損傷作用。Dragun等報道的16例AT1-AA引起的血管性排斥反應患者中只有5例C4d陽性，說明其排斥進程與HLA抗體介導的血管性排斥反應有所區(qū)別。我們推測AT1-AA介導的血管性排斥反應機制并非如HLA抗體那樣結合細胞表面抗原后激活補體導致細胞的損傷，其可能的機制是與靶細胞表面的ATIR結合后啟動細胞內信號轉導機制，促進細胞的增殖或凋亡。為驗證以上假設，我們將觀察內皮細胞(endothe

7、lial cell，EC)受到AT1-AA刺激后的功能改變，細胞間粘附分子-1(Intercellularadhesion molecule-1，ICAM-1)作為急性排斥反應和內皮激活的重要指標將作為檢測對象。 體液性排斥反應學說認為EC是抗體作用的最初靶點。血管內皮細胞在血液和組織液間有廣泛的聯(lián)系和物質交換，不僅具有選擇性通透性、抗血栓性、血管緊張調節(jié)、毛細血管形成、產生細胞因子、粘附因子及抗腫瘤活性等功能。細胞間粘附分子-

8、1是免疫球蛋白超家族中的一員，文獻報道急性排斥反應時，腎小管上皮細胞和腎血管內皮細胞上ICAM-1表達明顯增加，且腎小管上皮細胞上ICAM-1的表達與排斥的嚴重性呈正相關。ICAM-1不僅是急性排斥反應的始動因素，而且在免疫應答和移植物的排斥反應中發(fā)揮重要作用。AT1-AA是否會刺激內皮細胞增殖，導致ICAM-1的合成與分泌增加從而加重或啟動血管性排斥反應尚無相關研究報道。本實驗將用AT1-AA刺激培養(yǎng)的大鼠動脈內皮細胞，檢測ICAM-

9、1的合成和釋放是否增加。有研究顯示，AngII與ATIR結合后是通過MAPK、JAK/STAT等信號轉導通路實現(xiàn)生物學功能，特別是在內皮細胞損傷、血管平滑肌細胞增殖和動脈粥樣硬化的形成方面發(fā)揮作用。我們推測AT1-AA可能是通過與這些細胞表面的配體(ATIR)結合，轉導細胞內信號。本實驗將研究MAPKs信號轉導通路在AT1-AA介導內皮細胞功能變化中的作用。 對AT1-AA進行研究必須獲得一定數量的AT1-AA，并對其進行檢測和

10、鑒定。我們擬用大鼠ATIR多肽免疫大鼠，觀察是否可誘導產生AT1-AA；將AT1-AA注射到腎移植大鼠，觀察是否引發(fā)排斥反應，探討AT1-AA對腎血管內皮細胞的信號轉導途徑，然后選用可能的阻斷方法。通過上述研究，闡明同種AT1-AA確可介導早期體液性排斥反應、缺血再灌注損傷的移植腎內皮細胞為抗體作用的主要靶點、AT1-AA與受體結合后的主要信號轉導通路。本課題對于揭示AT1-AA介導體液性排斥反應的發(fā)生、作用機理具有重要意義，為臨床監(jiān)測

11、和治療這一特殊類型排斥反應提供理論依據。 主要研究內容： 1.本研究擬用大鼠源性ATIR多肽片段偶聯(lián)血藍蛋白制備抗原并免疫大鼠，監(jiān)測免疫的大鼠體內是否產生AT1-AA，如有AT1-AA生成則對其進行分離、純化和鑒定，并觀察其對自身組織有無病理性損傷。 2.采用制備的大鼠源性AT1-AA注射到腎移植受體大鼠，觀察受體大鼠是否發(fā)生急性血管性排斥反應，并重點觀察血管內皮細胞有無損傷；給予口服氯沙坦有無保護作用。

12、 3.在體外實驗中觀察AT1-AA對培養(yǎng)的內皮細胞的作用，監(jiān)測內皮細胞受到AT1-AA刺激后ICAM-1的表達變化。研究AT1-AA誘導內皮細胞ICAM-1表達的信號通路，探討AT1-AA介導內皮細胞ICAM-1變化的分子機制。使用氯沙坦阻斷對信號轉導通路及ICAM-1合成有無影響，探討氯沙坦是否可作為臨床預防和治療AT1-AA所致排斥反應的措施。 結論： 1.大鼠源性ATIR多肽能夠誘導大鼠產生ATIR自身抗體，此抗體

13、對自身組織的損傷作用不明顯。本實驗證實了大鼠源性AT1-AA的存在，并成功的對抗體進行分離、純化，為進一步研究其在器官移植中的作用提供了實驗基礎。 2.采用制備的大鼠源性AT1-AA注射到腎移植受體大鼠，觀察發(fā)現(xiàn)受體大鼠發(fā)生急性血管性排斥反應，光鏡和電鏡顯示移植腎血管內皮細胞有明顯損傷。 3.AT1-AA可引起部分難治性血管性排斥反應，推測其可能機制是與內皮細胞表面ATIR結合后啟動細胞內信號轉導通路，造成內皮功能紊亂，

14、表現(xiàn)之一是合成并分泌ICAM-1，進而導致白細胞浸潤并進一步破壞內皮細胞結構和功能，形成惡性循環(huán)，最終導致移植物失功。使用ATIR阻斷劑(如氯沙坦)可以減輕這種排斥反應，對移植腎有益，提示臨床移植前后需要檢測受體AT1-AA水平，特別是既往妊高癥或惡性高血壓患者，治療AT1-AA引起的排斥反應可以早期使用ARBs。 4.用AT1-AA刺激培養(yǎng)的大鼠動脈內皮細胞，可以誘導IC AM-1的合成和釋放增加，AT1- AA可以活化ERK