細胞膜鈣調(diào)節(jié)蛋白在心肌缺血預適應及藥物誘導預適應中作用的實驗研究.pdf

1、目的：對缺血預適應(IPC)現(xiàn)象產(chǎn)生機制的研究有望為心肌缺血/再灌注損傷的防治提供一個新的途徑。前人的研究顯示細胞內(nèi)鈣離子([Ca2+]i)的變化與IPC有密切關系。心肌缺血早期即發(fā)生的細胞內(nèi)鈣濃度增高是IPC必不可少的觸發(fā)因素；維持細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)是IPC保護作用的重要機制之一。以往認為細胞膜L-鈣通道是心肌缺血/再灌注時細胞內(nèi)鈣超載的Ca2+來源，近來研究發(fā)現(xiàn)鈉鈣交換蛋白(NCX)是缺血/再灌注時Ca2+進入細胞內(nèi)的主要途徑，且在缺血早

2、期阻斷NCX鈣流入模式(外向電流)可有良好的心肌保護作用。但目前對于細胞膜鈣調(diào)節(jié)蛋白在缺血/再灌注及IPC各階段中具體的作用機制包括基因表達及蛋白活性的改變并未完全明確。利用IPC作用機制中的活性產(chǎn)物模擬的藥理性預適應雖在動物實驗中可取得良好的心肌保護作用，但臨床療效欠佳。本研究從基因轉(zhuǎn)錄及蛋白活性方面觀察細胞膜鈣調(diào)節(jié)蛋白在IPC及藥理性預適應中功能的改變，以探討其在IPC始動環(huán)節(jié)中的可能作用。并采用中藥白花前胡的有效單體前胡丙素誘導I

3、PC樣的心肌保護作用，以尋找安全有效的保護心肌藥物并探討其可能的作用機制。 方法：1.以改良的Simpson等的方法進行SD乳鼠心肌細胞培養(yǎng)建立缺血/再灌注及IPC模型及腺苷、前胡丙素干預模型，全自動生化分析儀檢測乳酸脫氫酶(LDH)漏出率、臺盤蘭染色法記數(shù)細胞死亡率、透射電鏡觀察細胞超微結(jié)構(gòu)變化檢驗模型的有效性。2.設立缺血/再灌注組、IPC組、腺苷預處理組、前胡丙素預處理組、鈣調(diào)素依賴蛋白激酶Ⅱ(calmodulin-dep

4、endentproteinkinaseⅡ，CaMKⅡ)抑制劑KN-93+IPC組、KN-93+腺苷預處理組、KN-93+前胡丙素預處理組及正常對照組。檢測各組LDH漏出量；半定量RT-PCR檢測NCX基因轉(zhuǎn)錄改變；液閃儀測定Na+依賴的Ca2+攝取率的方法檢測NCX蛋白活性改變，定磷比色法檢測細胞膜鈣ATP酶(plasmamembranecalciumatpase,PMCA)蛋白活性變化。 結(jié)果：1.模擬缺血4h后LDH漏出率、

5、細胞死亡率與對照組比較有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)，并隨缺血時間延長LDH漏出率及細胞死亡率逐步升高。2.培養(yǎng)細胞以模擬缺血90min、再灌60min后進行9h長時缺血、1h再灌注，與單純9h長時缺血、1h再灌注組比較顯著降低LDH漏出率及細胞死亡率(P＜0.01)。長時間缺血/再灌注前在培養(yǎng)基中加入終濃度100μmol/L的前胡丙素或終濃度10μmol/L的腺苷預培養(yǎng)1h顯著降低LDH漏出率及細胞死亡率(P＜0.01)。透射電鏡下觀

6、察，單純?nèi)毖?再灌注組見染色質(zhì)碎裂邊集，肌漿網(wǎng)囊泡狀變性，線粒體空泡狀變；IPC組及腺苷預處理組、前胡丙素預處理組基本保持細胞超微結(jié)構(gòu)完整，少數(shù)線粒體空泡狀變。3.缺血預適應組與腺苷預處理組、前胡丙素預處理組在降低心肌細胞缺血/再灌注時LDH漏出量(P＜0.001)，同時也降低缺血/再灌注時鈉鈣交換蛋白轉(zhuǎn)錄水平及蛋白活性的上調(diào)(P＜0.01；P＜0.005)；這些作用被KN-93阻斷。4各組之間PMCA活性無明顯差別(P＞0.05)。