造血干細(xì)胞移植預(yù)處理誘發(fā)口腔黏膜炎大鼠口腔黏膜組織中NF-κB、IL-1β和TNF-α的表達(dá)及意義.pdf

1、本文擬在初步建立造血干細(xì)胞移植預(yù)處理誘發(fā)口腔黏膜炎(CTOM)模型的基礎(chǔ)上進(jìn)一步完善該模型，以期解決該模型現(xiàn)存的成模率低、動(dòng)物死亡率高等問題；并探討NF-κB、IL-1β、TNF-α水平在CTOM中的改變，為明確CTOM發(fā)病機(jī)制提供初步研究依據(jù)。 研究目的： 1.完善CTOM動(dòng)物模型。 2.探討NF-κB、IL-1β、TNF-α在CTOM中的表達(dá)及意義。 研究材料與方法： 1.優(yōu)化BUCY預(yù)處理給

2、藥方案采用BUCY(馬利蘭Busulfan，環(huán)磷酰胺Cyclophosphamide)預(yù)處理方案，實(shí)驗(yàn)第1、2、3天灌胃給予馬利蘭，第1、2天腹腔注射環(huán)磷酰胺，第3和/或4天麻醉下搔刮左頰黏膜至輕度充血。將96只雄性SD大鼠分為16組，每組BUCY劑量不同，進(jìn)行摸索，結(jié)果顯示在氨基酸(劑量約3.0g/kg/d)提供營養(yǎng)支持的條件下，BUCY預(yù)處理方案在馬利蘭8.0mg/kg/d(總劑量為24.0mg/kg)、環(huán)磷酰胺120mg/kg/d

3、(總劑量為240mg/kg)時(shí)為CTOM動(dòng)物模型最優(yōu)給藥方案。(詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟見附件2)。 2.完善CTOM動(dòng)物模型65只SD大鼠隨機(jī)抽取41只作為模型組(模型1組15只，不處死、觀察CTOM自然過程；模型2組26只，不同時(shí)點(diǎn)處死、動(dòng)態(tài)觀察CTOM)，24只為對(duì)照組(對(duì)照1組12只，進(jìn)行搔刮；對(duì)照2組12只，不作任何處理)。實(shí)驗(yàn)第1、2、3天灌胃給予馬利蘭8.0mg/kg/d、第1、2天腹腔注射環(huán)磷酰胺120mg/kg/d，第3和

4、/或4天麻醉下搔刮左頰黏膜至輕度充血。每天評(píng)估OM指數(shù)、記錄大鼠體重等，分別于3、4、6、8、10、12、14天處死大鼠，收集血液、骨髓和口腔黏膜潰瘍組織標(biāo)本，檢測(cè)血象、骨髓象，組織標(biāo)本進(jìn)行病理分析。 3.NF-κB、IL-1β、TNF-α的檢測(cè)復(fù)制CTOM動(dòng)物模型30只，根據(jù)實(shí)驗(yàn)1所收集的資料，選擇有特征性變化趨勢(shì)的第4、5、9、12、14天處死動(dòng)物，收集黏膜標(biāo)本，標(biāo)本沿中線分為兩部分。部分用于免疫組織化學(xué)，部分用于酶聯(lián)免疫吸

5、附實(shí)驗(yàn)。 3.1免疫組織化學(xué)分析標(biāo)本中性福爾馬林固定后，進(jìn)行‘包埋、切片。免疫組化染色檢測(cè)NF-κB、IL-1β、TNF-α的表達(dá)，光鏡下觀察NF-κB、IL-1β、TNF-α的動(dòng)態(tài)分布特點(diǎn)。 3.2酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)分析液氮凍存的標(biāo)本，冰浴下勻漿、提取總蛋白、測(cè)定蛋白含量。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各樣品IL-1β、TNF-α濃度、計(jì)算細(xì)胞因子相對(duì)含量，進(jìn)行各因子與OM指數(shù)的相關(guān)性分析。 研究結(jié)果： 1.CTO

6、M動(dòng)物模型的完善模型組41只大鼠CTOM總體發(fā)生率為80.49％(33/41)，其中3-4級(jí)OM為63.64％(21/33)。模型1組大鼠CTOM發(fā)生率為80％(12/15)，其中3-4級(jí)CTOM為58.34％(7/12)?？谇惑w征為早期出現(xiàn)點(diǎn)狀紅斑或局部白色水腫，隨后表現(xiàn)為點(diǎn)狀糜爛、潰瘍形成，假膜覆蓋；潰瘍持續(xù)時(shí)間約8-9天。鏡下表現(xiàn)為上皮脫落，潰瘍形成，上皮下少量炎癥細(xì)胞浸潤。OM指數(shù)在第5天達(dá)到最高點(diǎn)(2.26±0.79)，到第1

7、4天為0。大鼠體重在用藥后持續(xù)下降，第9天體重達(dá)最低點(diǎn)(98.50±20.27g)后開始緩慢上升。骨髓極度抑制出現(xiàn)第4-6天，同時(shí)白細(xì)胞計(jì)數(shù)值達(dá)最低(0.25±0.05109/L)，隨后骨髓增生逐漸恢復(fù)至基本正常狀態(tài)，白細(xì)胞計(jì)數(shù)值緩慢上升。 2.IHC結(jié)果第4天，口腔黏膜上皮和上皮下NF-κB、IL-1β和TNF-α表達(dá)均為陽性；潰瘍形成后，NF-κB表達(dá)陰性，IL-1β和TNF-α表達(dá)呈陽性；第14天，即口腔黏膜完全修復(fù)后，N

8、F-κB又出現(xiàn)陽性表達(dá)，IL-1β、TNF-α表達(dá)陰性。 3.ELISA細(xì)胞因子水平及其與OM指數(shù)的關(guān)系IL-1β水平在第4天最高，其余時(shí)點(diǎn)IL-1β水平較低。第4天IL-1β濃度為39.50±6.35pg/ml，IL-1β相對(duì)含量=0.3207±0.0423pg/mg。模型組與對(duì)照組及模型組不同時(shí)點(diǎn)的黏膜標(biāo)本IL-1β水平差異有顯著性(P＜0.01)。各時(shí)點(diǎn)和正常黏膜標(biāo)本的TNF-α水平均較低，模型組與對(duì)照組及模型組不同時(shí)點(diǎn)的

9、黏膜標(biāo)本TNF-α水平差異有顯著性(P＜0.01)。對(duì)IL-1β、TNF-α與OM指數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析后，OM指數(shù)與IL-1β水平(r=0.4343，P=0.024)表達(dá)顯著相關(guān)。 研究結(jié)論： CTOM動(dòng)物模型在發(fā)病率、臨床表現(xiàn)及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)等各方面基本模擬了臨床CTOM患者的變化。 口腔黏膜中IL-1β和TNF-α在CTOM發(fā)生發(fā)展過程中低水平表達(dá)，且IL-1β與OM指數(shù)相關(guān)有顯著性，提示IL-1β可能與CTOM發(fā)