阻斷腺苷A-,2A-受體對(duì)小鼠大腦中動(dòng)脈局灶缺血性損傷的影響.pdf

1、背景：卒中是導(dǎo)致人類死亡的主要疾病之一，是疾病致殘的首位病因。缺血性卒中是卒中的主要類型。盡管國內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量的研究，目前仍無肯定有效的神經(jīng)保護(hù)劑投入臨床治療缺血性卒中，迫切需要探索新的神經(jīng)保護(hù)途徑。腺苷是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的神經(jīng)調(diào)質(zhì)，目前已克隆出4種腺苷特異性受體亞型，即A1、A2A. A2B及A3受體。腺苷參與調(diào)節(jié)腦內(nèi)重要的生理功能。腺苷活動(dòng)異常與某些神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，對(duì)其干預(yù)可能阻止或逆轉(zhuǎn)疾病過程。以往動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)腺

2、苷A2A受體拮抗劑對(duì)神經(jīng)元缺血性損傷具有保護(hù)作用，但確切的作用環(huán)節(jié)和機(jī)制仍不明確，有必要進(jìn)一步探討。 眾所周知，在急性腦缺血發(fā)生后，缺血性腦損害的發(fā)展將經(jīng)歷多個(gè)階段，其中主要包括急性期損害、再灌注損害和腦水腫。腦缺血數(shù)分鐘后，隨著細(xì)胞能量耗竭，引起細(xì)胞酸中毒、細(xì)胞膜功能和結(jié)構(gòu)損害，發(fā)生早期神經(jīng)損傷。腦缺血誘發(fā)腦內(nèi)谷氨酸過度釋放，谷氨酸通過激活NMDA受體使細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流，并促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存鈣釋放，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)游離鈣增加，由此激活細(xì)

3、胞內(nèi)脂酶和蛋白酶，破壞細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，并引發(fā)系列信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。研究證實(shí)，位于谷氨酸能神經(jīng)元突觸前的A2A受體被激活后，可以促進(jìn)谷氨酸的釋放。因此，推測腦缺血后腺苷A2A受體的激活可能由于促進(jìn)谷氨酸的釋放而加重了鈣超載。再灌注后隨著組織血流恢復(fù)，大量氧自由基產(chǎn)生，炎性介質(zhì)表達(dá)增加，造成細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)損傷和DNA斷裂，多種機(jī)制共同作用引起再灌注損傷、血腦屏障破壞和腦水腫形成。腦水腫是腦缺血后再灌注損傷的重要病理環(huán)節(jié)，可引起和加重遲發(fā)性神經(jīng)元損傷。

4、實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，水通道蛋白4(Aquaporin，AQP4)在缺血性卒中后表達(dá)增高，與腦水腫形成一致。研究證實(shí)，位于血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的A2A受體被激活后能擴(kuò)張腦血管。由此推測腦缺血后再灌注階段A2A受體的激活可能由于擴(kuò)張腦血管而加重腦水腫。 盡管以往動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)阻斷腺苷A2A受體能夠減輕缺血性腦損傷，但由于對(duì)組織病理損害的觀察時(shí)點(diǎn)僅限于再灌注后，也無對(duì)腦水腫影響的研究報(bào)道，因此難以清楚解釋阻斷腺苷A2A受體減輕缺血性腦損傷

5、的可能作用環(huán)節(jié)和機(jī)制。因此有必要進(jìn)一步探討阻斷A2A受體對(duì)腦缺血后不同時(shí)相、不同類型病理損傷的影響。 目的：本研究利用腺苷A2A受體基因敲除小鼠建立大腦中動(dòng)脈缺血/再灌注模型，針對(duì)急性缺血性腦損傷不同時(shí)相和病理損傷類型，初步探討阻斷A2A受體對(duì)于缺血性腦損傷保護(hù)效應(yīng)的作用環(huán)節(jié)，期望為解釋其保護(hù)作用機(jī)制提供線索。 方法： 1.腺苷A2A受體基因敲除(A2ARKO)小鼠及同窩野生型(A2ARWT)小鼠各分為腦缺血2h

6、組、腦缺血后再灌注22h組和腦缺血后再灌注46h組。 2.線栓法制作大腦中動(dòng)脈阻塞模型。 3.腦組織切片甲酚紫染色結(jié)合圖象分析技術(shù)測定腦梗死體積。 4.干濕重法測定腦組織含水量。 5.免疫組化染色檢測鈣結(jié)合蛋白(Calbindin D-28k，CB)和水通道蛋白4。 結(jié)果： 1.在腦缺血2h、腦缺血后再灌注22h和腦缺血后再灌注46h，測定A2ARKO組的腦梗死體積均顯著小于A2ARWT組

7、的梗死體積(P<0.01) 2.光鏡下見鈣結(jié)合蛋白免疫反應(yīng)陽性物質(zhì)位于神經(jīng)元細(xì)胞漿，免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞主要分布于海馬和皮質(zhì)，在梗死灶周邊區(qū)計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞并做組間比較。腦缺血2h，與假手術(shù)組比較，A2ARWT組鈣結(jié)合蛋白免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞顯著較少(P0.05)。腦缺血后再灌注22h和46h，與假手術(shù)組比較，A2ARKO組和A2ARWT組鈣結(jié)合蛋白免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞均顯著較少(P<0.05，P<

8、0.01)。在腦缺血后各時(shí)點(diǎn)的比較，A2ARKO組鈣結(jié)合蛋白免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞均顯著多于A2ARWT組(P<0.01)。A2ARKO組和A2ARWT組，在缺血2h與再灌注22h時(shí)點(diǎn)比較無顯著差異(P>0.05)；與缺血2h及再灌注22h時(shí)點(diǎn)比較，再灌注46h時(shí)點(diǎn)鈣結(jié)合蛋白免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞顯著減少(P<0.01) 3.光鏡下見AQP4免疫反應(yīng)陽性物質(zhì)位于細(xì)胞膜下，主要表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞，也見于血管內(nèi)皮細(xì)胞和室管膜細(xì)胞，梗死灶周邊區(qū)陽

9、性細(xì)胞較多。在梗死灶周邊計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞并做組間比較。在腦缺血后各時(shí)點(diǎn)，與假手術(shù)組比較，A2ARKO組和A2ARWT組AQP4免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞均顯著增多(P<0.01)。腦缺血2h、腦缺血后再灌注22h和46h，A2ARKO組AQP4免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞均顯著少于A2ARWT組(P<0.05，P<0.01，P<0.01)。A2ARKO組，與缺血2h時(shí)點(diǎn)比較，再灌注22h及再灌注46h時(shí)點(diǎn)AQP4免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞顯著增多(P<0.01)；與再灌注

10、22h時(shí)點(diǎn)比較，再灌注46h時(shí)點(diǎn)AQP4免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞顯著增多(P<0.05)。A2ARWT組，在腦缺血后各時(shí)點(diǎn)比較均有顯著差異(P<0.01)，隨著缺血時(shí)間延長，AQP4免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞逐漸增多。 4.腦缺血2h后再灌注46h，A2ARWT組和A2ARKO組腦梗死側(cè)的組織含水量均顯著大于非梗死側(cè)(P<0.01)。與A2ARWT組比較，A2ARKO組腦梗死側(cè)的組織含水量顯著較少(P<0.05)，非梗死側(cè)無顯著差異(P>0.05

11、) 5. A2ARKO組和A2ARWT組腦梗死體積與CB免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)間均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.764，p<0.01；r=-0.506，p<0.05)； A2ARKO組和A2ARWT組腦梗死體積與AQP4免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)間均呈正相關(guān)(r=0.837，p<0.01；r=0.809，p<0.01)。 結(jié)論： 1.阻斷腺苷A2A受體對(duì)腦缺血急性期和再灌注期損傷均有保護(hù)作用； 2.阻斷腺苷A2A受體可減輕缺血