神經(jīng)元Nogo-A分子信號與功能的初步研究.pdf

1、髓鞘來源的中樞神經(jīng)再生抑制因子—Nogo-A 自2000年被克隆以來，其抑制神經(jīng)再生的機制已經(jīng)被廣泛研究?，F(xiàn)在知道，寡突膠質(zhì)細胞上表達的Nogo-A 通過神經(jīng)元表面的NgR/ p75NTR（或者TROY）/LINGO-1 受體復(fù)合物抑制神經(jīng)元突起的生長。雖然目前有很多實驗室利用在體和體外干預(yù)實驗來封閉與Nogo 相關(guān)的抑制信號，并取得了比較顯著的神經(jīng)突起生長和神經(jīng)再生。但是，2003年Schwab、Strittmatter和Tessie

2、r-Lavigne 三家實驗室利用不同的基因敲除策略進行了Nogo基因剔除的實驗，并沒有得到一致證據(jù)支持Nogo 與中樞神經(jīng)再生的直接關(guān)系。 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，Nogo-A 不僅高表達于成熟的少突膠質(zhì)細胞，而且在多種類型的神經(jīng)元中也廣泛表達。我們實驗室以前的研究顯示神經(jīng)元表達的Nogo-A蛋白除少量定位于細胞膜上，主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、多聚核糖體和細胞核內(nèi)的染色質(zhì)上，提示Nogo-A 可能與某些神經(jīng)元的功能有關(guān)。通過Nogo-A蛋白

3、的一級結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，Nogo-A的氨基端不僅存在潛在的核進入位點，還富含酸性氨基酸和多個可能與很多帶WW、SH3 結(jié)構(gòu)域的信號分子相互作用的脯氨酸豐富（Proline Rich）結(jié)構(gòu)，提示Nogo-A 很有可能作為重要的調(diào)節(jié)蛋白參與神經(jīng)元中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。 作為揭示Nogo-A 神經(jīng)元功能的系列研究的一部分，本課題主要以人胚胎腎細胞系HEK293FT為模型來研究Nogo-A 可能調(diào)節(jié)的下游轉(zhuǎn)錄信號及其機制，并在此基礎(chǔ)上利用PC12細

4、胞分化模型初步研究Nogo-A 對神經(jīng)元分化和突起生長的調(diào)節(jié)作用。主要獲得的結(jié)果如下：（一）在HEK293FT細胞系中，利用信號途徑報告基因系統(tǒng)篩選過表達Nogo-A 對多種信號途徑的調(diào)控作用時，發(fā)現(xiàn)Nogo-A 能特異激活NF-κB 信號，并且Nogo-A 對NF-κB 信號的激活是Nogo-A 劑量依賴的。（二）利用不同的Nogo-A 剪接體和截斷體形式研究證明Nogo-A 激活NF-κB 信號依賴于其氨基端的Proline R

5、ich 結(jié)構(gòu)域。（三）進一步使用NF-κB 信號途徑相關(guān)分子顯性突變體揭示IκB α、TRAF6、Rac/Cdc42 參與Nogo-A 激活NF-κB 信號。（四）利用純化的GST-NogoA 截斷體蛋白胞外作用HEK293細胞，發(fā)現(xiàn)它們對細胞內(nèi)的NF-κB 活性沒有明顯的影響，提示Nogo-A對NF-κB 信號的激活不是通過分泌到細胞外的蛋白片段作用于相應(yīng)受體介導(dǎo)的。（五）利用RNAi 技術(shù)下調(diào)PC12細胞中Nogo-A的表達，

6、可以有效的抑制NGF 誘導(dǎo)PC12細胞分化過程中NF-κB 信號的激活。（六）觀察到在PC12細胞中瞬時過表達NogoA，NGF 誘導(dǎo)3天后發(fā)現(xiàn)過表達Nogo-A 對NGF 誘導(dǎo)PC12 分化和突起生長并沒有影響；我們同時構(gòu)建了穩(wěn)定表達PMIR-Nogo-A和對照載體PMIR-Control的PC12細胞系，NGF 誘導(dǎo)后發(fā)現(xiàn)下調(diào)PC12 中Nogo-A的表達對NGF 誘導(dǎo)PC12 分化也沒有影響。 結(jié)果提示，Nogo-A 可