家蠶Sericin-1啟動子組織專一性相關(guān)功能序列的分析.pdf

1、家蠶(Silkworm)是最早人工飼育的經(jīng)濟昆蟲之一。幾千年來，家蠶因為其強大的合成和分泌絲蛋白(絲素和絲膠)能力而備受人類關(guān)注。絲腺是合成和分泌絲蛋白的特殊器官，從形態(tài)和功能上可以分為三部分：前部絲腺(ASG)、中部絲腺(MSG)和后部絲腺(PSG)。絲蛋白的大量合成和分泌是在五齡起第3日開始的，后部絲腺特異性的合成和分泌絲素蛋白，而中部絲腺特異性地合成和分泌絲膠蛋白。兩種絲蛋白基因的時間特異性和組織特異性表達現(xiàn)象，引起了研究者們廣泛

2、的興趣?；虮磉_受多種調(diào)控因子的多級調(diào)節(jié)，其中啟動子的調(diào)控占有十分重要的地位。因此，研究絲蛋白基因啟動子的功能序列對于深入了解基因的表達調(diào)控機制具有十分重要的意義。 目前已有5種絲膠基因被克隆和分離，分別被稱為Ser1、Ser2、MSGS3、MSGS4和MSGS5，其中Ser1基因是絲膠蛋白的主要表達基因。GuoXY等將EGFP報告基因連接在1.6Kbp長的Ser1基因啟動子序列及信號肽序列下游，構(gòu)建含上述表達框的重組桿狀病毒(

3、Acserpegfp△EGT)。五齡起蠶時，將Acserpegfp△EGT注射入家蠶體腔，通過熒光解剖顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)：報告基因EGFP能夠絲腺特異性地分泌表達.然而，Ser1基因這種組織特異性表達現(xiàn)象的內(nèi)在機理還很不清楚。 本研究利用AcMNPV介導的體內(nèi)瞬時表達方法，對Ser1基因的啟動子序列進行部分刪除，通過分析EGFP報告基因的表達，研究Ser1啟動子序列中與絲腺組織專一性表達相關(guān)的元件。首先，對Ser1基因全長啟動子進行

4、了5’端分段順次缺失，用PCR方法構(gòu)建得到6種不同長度的Ser1啟動子序列。將這6種Ser1啟動子序列分別與報告基因EGFP連接構(gòu)建表達盒，分別裝入轉(zhuǎn)移載體pFFa2中，成功獲得6種重組的轉(zhuǎn)移載體：pFFa2-1.2serEGFP，pFFa2-0.92serEGFP，pFFa2-0.64serEGFP，pFFa2-0.43serEGFP，pFFa2-0.27serEGFP和pFFa2-0.18serEGFP。通過Bac-to-Bac系統(tǒng)

5、制備6種重組桿狀病毒Ac1.2serEGFP、Ac0.92serEGFP、Ac0.64serEGFP、Ac0.43serEGFP、Ac0.27serEGFP和Ac0.18serEGFP。這些重組病毒分別經(jīng)注射感染五齡起家蠶，通過熒光顯微鏡觀測蠶組織中EGFP基因的表達發(fā)現(xiàn)：啟動子轉(zhuǎn)錄起始點上游一個209bp區(qū)段(-586bp～-378bp)參與報告基因的絲腺組織專一性表達，含有該209bp區(qū)段的Ser1啟動子控制的EGFP基因僅在絲腺中

6、特異性表達；刪除該段后，Ser1啟動子控制的下游EGFP報告基因可以在家蠶絲腺以外的其它組織(如脂肪體)中表達。 其次，為了進一步分析可能的順式作用元件存在范圍，對這209bp區(qū)段序列進行了內(nèi)部部分刪除分析，使用PCR技術(shù)產(chǎn)生6個有交疊的啟動子刪除片段。將報告基因EGFP分別置于這6組部分刪除后的Ser1啟動子控制下，構(gòu)建攜帶報告基因表達盒的重組桿狀病毒AcserA1ABEGFP～AcserA6ABEGFP，體腔注射感染五齡起蠶

7、，觀察報告基因EGFP在蠶絲腺和脂肪體中的表達。結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)錄起始點上游的25bp(-500bp～-476bp)與Ser1基因啟動子的絲腺組織專一性表達關(guān)系密切。缺失該25bp堿基會引起Ser1基因啟動子控制下的報告基因在脂肪體的異位表達。 此外，在五齡起蠶第2天，分別收集家蠶中部絲腺和脂肪體組織，制備兩種組織的核蛋白抽提物。同時，在209bp區(qū)間合成9對寡核苷酸，并在Klenow酶的作用下用[α-P32]dATP制備9條標記探

8、針。將核蛋白抽提物與探針進行凝膠阻滯試驗，初步分析參與調(diào)控的DNA順式元件以及結(jié)合蛋白。結(jié)果表明：家蠶脂肪體中富含一種未鑒定的蛋白因子，該蛋白可以與Ser1啟動子上游的25bp(-500bp～-476bp)區(qū)域結(jié)合，抑制Ser1基因在脂肪體的異位表達，從而調(diào)控Ser1基因的絲腺組織專一性表達。 研究結(jié)果表明，Ser1基因絲腺專一性表達是多元件、多因子的協(xié)調(diào)作用所致。除了已知的SA、SB和SC順式元件及相關(guān)的反式作用因子SGF-1

9、/Fhx和SGF-3/POU-M1外，還有-500bp～-476bp區(qū)域及識別并結(jié)合該區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)同作用。后兩者在抑制Ser1基因在絲腺外的其它組織(如脂肪體)中表達有重要作用。因此，Ser1基因的特異性表達既有增強性元件又有抑制性元件的參與；增強元件增強Ser1在絲腺表達，抑制元件抑制了Ser1在絲腺外的其它組織表達。 開展絲膠基因的調(diào)控研究，有助于了解絲蛋白產(chǎn)生的機制，為進一步利用家蠶絲腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)高附加值有用蛋白