UBE3C在原發(fā)性肝癌中的突變及生物學(xué)特性研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌（hepatocellular carcinoma, HCC）在全球常見惡性腫瘤中居第六位，在腫瘤相關(guān)性死亡中居第三位。據(jù)最新統(tǒng)計(jì)，全球每年約有74.8萬新發(fā)肝癌病例，約有75萬人死于肝癌，其中半數(shù)發(fā)生在中國(guó)。雖然在肝癌早期診斷、手術(shù)切除、肝臟移植方面取得了諸多進(jìn)步，肝癌患者的生存率得到提高，但肝癌患者的總體預(yù)后仍然很差。肝癌的發(fā)病機(jī)制至今仍不十分清楚，與之相關(guān)的易感基因也很缺乏。因此，肝癌相關(guān)的新的易感基因的發(fā)現(xiàn)將為肝癌的預(yù)

2、防、高危人群的篩查和早期診斷提供生物學(xué)標(biāo)志，并為開發(fā)全新的藥物和基因治療提供靶點(diǎn)。
　　腫瘤的發(fā)生是個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程，基因變化引起的原癌基因的活化和抑癌基因的失活是其核心。與其他實(shí)體腫瘤類似，HCC在其自身發(fā)生、發(fā)展過程中亦累積了大量遺傳變異，這些遺傳變異逐漸累積形成癌前病變并最終演進(jìn)為腫瘤?，F(xiàn)已知道，HCC的形成是一個(gè)多因素、多步驟的組織學(xué)發(fā)展過程。大部分HCC發(fā)生在由各種原因?qū)е碌母斡不尘吧?，由慢性乙型或丙型肝炎—異型增?/p>

3、結(jié)節(jié)(Dysplastic Nodules，DN)-HCC逐漸演化、發(fā)展而來。因此，通過對(duì)比正常細(xì)胞基因組、DN基因組和HCC基因組遺傳變異之間的差異，可以發(fā)現(xiàn)與HCC相關(guān)的較早期遺傳變異。
　　近年來，新一代測(cè)序技術(shù)(Next-generation sequencing)的進(jìn)步，促進(jìn)了全基因組測(cè)序和全基因組外顯子測(cè)序的快速發(fā)展，并被廣泛運(yùn)用于復(fù)雜疾病如癌癥易感基因的研究和臨床診斷中。外顯子區(qū)域包含著合成蛋白質(zhì)所需要的信息，涵蓋了

4、與個(gè)體表型相關(guān)的大部分功能性變異，同時(shí)外顯子區(qū)域是目前基因組中被研究得最為成熟的一部分，使得我們能夠?qū)Πl(fā)現(xiàn)的變異所在的基因進(jìn)行注釋和功能途徑分析。由于外顯子僅占整個(gè)基因組的1％左右，因此遠(yuǎn)比進(jìn)行全基因組序列測(cè)序更經(jīng)濟(jì)、高效。由于其具有對(duì)常見和罕見變異高靈敏度，能發(fā)現(xiàn)外顯子區(qū)絕大部分疾病相關(guān)變異，促使全外顯子測(cè)序成為鑒定孟德爾疾病的致病基因最有效的策略，也被廣泛運(yùn)用于復(fù)雜疾病如癌癥易感基因的研究和臨床診斷中。本研究旨在通過對(duì)正常細(xì)胞基因組

5、DNA、DN基因組DNA以及HCC基因組DNA進(jìn)行全外顯子測(cè)序分析，尋找與肝癌有關(guān)的新的遺傳變異位點(diǎn)，并對(duì)篩選出的候選基因進(jìn)行相應(yīng)的功能研究。
　　第一部分全外顯子測(cè)序?qū)ふ腋伟┫嚓P(guān)遺傳變異位點(diǎn)
　　目的:通過對(duì)一例原發(fā)性肝癌病人的外周血淋巴細(xì)胞、肝臟異型增生結(jié)節(jié)(Dysplastic Nodules，DN)和兩個(gè)肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)組織共4個(gè)樣本進(jìn)行外顯子測(cè)序分析，尋找與肝癌相

6、關(guān)的新的遺傳變異位點(diǎn)。
　　方法:應(yīng)用Aliglent SureSelect人外顯子序列捕獲(50M)系統(tǒng)和Solexa測(cè)序技術(shù)，檢測(cè)肝臟DN和HCC外顯子區(qū)域的變異位點(diǎn)，通過比對(duì)外周血正常淋巴細(xì)胞外顯子區(qū)域的變異和NCBI的dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)，過濾掉共有的體細(xì)胞SNP變異，從而篩選出肝癌相關(guān)的遺傳變異位點(diǎn)，并應(yīng)用Sanger法測(cè)序技術(shù)對(duì)所篩選出的位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證。
　　結(jié)果:在DN中共發(fā)現(xiàn)5個(gè)新的單核苷酸變異(Single Nu

7、cleotide Variations，SNV)，在兩個(gè)HCC中分別發(fā)現(xiàn)72個(gè)和182個(gè)新的SNVs。其中兩個(gè)HCC均有SNVs的基因共兩個(gè)，分別為位于7號(hào)染色體上的UBE3C基因和19號(hào)染色體上的MUC16基因，均經(jīng)過Sanger測(cè)序法證實(shí)突變。在DN與HCC上均有SNVs的基因沒有發(fā)現(xiàn)。此外，在DN中未發(fā)現(xiàn)新的短插入/缺失(Small indel)變異，在兩個(gè)HCC中分別發(fā)現(xiàn)3個(gè)和9個(gè)新的Small indel變異，分別定位在12個(gè)

8、不同的基因上
　　結(jié)論:肝臟DN與HCC未發(fā)現(xiàn)共有變異基因，但兩個(gè)HCC中均發(fā)現(xiàn)基因UBE3C和MUC16存在變異，提示這兩個(gè)基因可能與肝癌發(fā)生密切相關(guān)。
　　第二部分候選基因UBE3C的驗(yàn)證及結(jié)構(gòu)分析
　　目的:探索泛素連接酶E3C(UBE3C)在原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)病例中的突變情況。
　　方法:在另一組105例HCC樣本中，應(yīng)用常規(guī)Sanger測(cè)序技術(shù)對(duì)U

9、BE3C的全部23個(gè)外顯子區(qū)域進(jìn)行測(cè)序，并分析UBE3C基因突變與肝癌臨床病理因素之間的關(guān)系。
　　結(jié)果:在全部106例（包含全外顯子測(cè)序1例）HCC樣本中，共有17例在UBE3C上存在堿基置換的非同義突變，基因突變率16.0％。這些突變位點(diǎn)分別位于UBE3C的5、7、13、20和22號(hào)外顯子上，其中Asn929Ile、Glu959Lys和Thr1004Ala三個(gè)位點(diǎn)的突變發(fā)生在UBE3C的進(jìn)化上高度保守的HECT結(jié)構(gòu)域(doma

10、in)上。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，UBE3C突變與患者性別、年齡、HBV DNA、肝硬化、腫瘤大小、包膜、分化及血管侵犯及腫瘤TNM分期等臨床病理因素均無關(guān)。
　　結(jié)論:UBE3C在HCC病例中存在多位點(diǎn)、高頻率的突變，Asn929Ile、Glu959Lys和Thr1004Ala的突變可能會(huì)對(duì)UBE3C的蛋白質(zhì)功能產(chǎn)生重要影響，參與HCC的發(fā)生、發(fā)展過程。
　　第三部分 UBE3C的腫瘤生物學(xué)特性研究
　　目的:研究泛素連接

11、酶E3C(UBE3C)在各種肝癌細(xì)胞系和肝癌組織的表達(dá)情況，并探索其對(duì)人肝癌細(xì)胞株Huh7和MHCC97-H生長(zhǎng)增殖及侵襲的影響。
　　方法:選用正常肝細(xì)胞系L-02和常見的肝癌細(xì)胞系SMMC-7721、Huh7、Hep3B、HCCLM3、MHCC97-H和MHCC97-L共7種不同的人肝癌細(xì)胞系，通過Western blot方法檢測(cè)上述細(xì)胞系中UBE3C蛋白表達(dá)及分布情況。應(yīng)用免疫組化方法觀察UBE3C在人肝癌組織及癌旁組織中的

12、表達(dá)情況。通過構(gòu)建穩(wěn)定敲減UBE3C的Huh7和MHCC97-H細(xì)胞株，觀察在敲減UBE3C后腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖、遷移及侵襲能力的變化。
　　結(jié)果:UBE3C在各肝癌細(xì)胞系中均有表達(dá)，且主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，在相對(duì)正常的L-02細(xì)胞中表達(dá)水平較低，而在具有較高侵襲潛能的MHCC97-H細(xì)胞和相對(duì)較低侵襲潛能的Huh7細(xì)胞系中則表達(dá)水平較高。在人肝癌組織標(biāo)本中，UBE3C蛋白主要存在于腫瘤細(xì)胞的胞漿中，且在癌組織中的表達(dá)水平高于癌旁組