GFP-α-tubulin-GFP-CENP-A-HeLa細胞系的建立及其功能評價.pdf

1、腫瘤作為慢性非傳染疾病已成為危害人類健康并導(dǎo)致死亡的頭號殺手，世衛(wèi)組織發(fā)布的最新癌癥報告顯示惡性腫瘤發(fā)病率與死亡率依然呈現(xiàn)迅猛增長的趨勢。因此從細胞分子水平研究腫瘤的發(fā)生機制，為腫瘤的治療及預(yù)防奠定基礎(chǔ)有著迫切的需要。隨著近年來分子影像學(xué)的發(fā)展，高分辨高速的活細胞成像顯微鏡系統(tǒng)日益成熟，這就為從細胞層面動態(tài)研究腫瘤的發(fā)生發(fā)展機制提供了強有力的工具。而如何應(yīng)用該技術(shù)，達到篩查治療腫瘤有效化學(xué)藥物的目標(biāo)，迫切需要構(gòu)建一種能夠反映化療藥物是否

2、損傷腫瘤細胞的、穩(wěn)定表達微管和著絲粒相關(guān)蛋白質(zhì)的熒光報告細胞系模型，通過觀察腫瘤細胞的行為變化，為腫瘤的治療提供有效的化療藥物篩查的工具。
　　細胞周期的錯誤調(diào)節(jié)可以導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。細胞周期中的有絲分裂過程是一個精細調(diào)節(jié)的過程，其中每一對染色體都需要正確的連接來自于兩極的微管，如果著絲粒與微管的附著錯誤就會導(dǎo)致染色體的排列錯誤，進而導(dǎo)致染色體分離的異常，促進染色體不穩(wěn)定性的發(fā)生，最終產(chǎn)生非整倍體的細胞，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。為了更直觀的

3、精確研究染色體與微管的運動結(jié)合過程，預(yù)期構(gòu)建標(biāo)記GFP綠色熒光蛋白質(zhì)的微管和著絲粒相關(guān)蛋白質(zhì)的腫瘤細胞系，從而利用活細胞顯微工作站來研究不同的化療藥物損傷腫瘤細胞的機制，為進一步研究腫瘤發(fā)生及篩查腫瘤化療藥物奠定基礎(chǔ)。
　　目的：
　　1.應(yīng)用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)，構(gòu)建穩(wěn)定表達 GFP綠色熒光蛋白質(zhì)的微管和著絲粒相關(guān)蛋白質(zhì)的腫瘤細胞模型。
　　2.應(yīng)用GFP-α-tubulin/GFP-CENP-A-HeLa細胞模型，觀察細

4、胞周期變化，來評價微管相關(guān)化療藥效果及機制。
　　方法：
　　1.分子克隆構(gòu)建慢病毒相關(guān)質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)入293T細胞中收集上清最終獲得可用于感染的慢病毒。
　　2.利用胸苷阻滯的細胞同步化方法獲得G1期阻滯的細胞，釋放后進入有絲分裂期前進行活細胞動態(tài)觀察。
　　3.利用實時動態(tài)活細胞工作站來動態(tài)觀察細胞有絲分裂的進程。
　　4.將細胞中加入Nocodazole及 Taxol化療藥，觀察微管動態(tài)變化及細胞凋亡的進

5、程。
　　結(jié)果：
　　1.通過分子克隆技術(shù)成功將表達CENP-A/α-tubulin片段插入到表達GFP的慢病毒載體中。利用293T細胞產(chǎn)生慢病毒并最終成功獲得表達GFP-CENP-A/α-tubulin的HeLa細胞系。
　　2.通過激光共聚焦顯微鏡觀察到在間期細胞中，存在微管結(jié)構(gòu)綠色熒光表達，提示該細胞系可用于活細胞觀察。
　　3.建立了基于HeLa細胞系的化學(xué)藥物同步化方法，成功地將HeLa細胞周期阻滯于G

6、1期，并通過釋放得到了處于G1/S,S,G2/M各個周期的細胞，為活細胞觀察奠定基礎(chǔ)。
　　4.利用Time-Lapse活細胞工作站，對表達GFP-CENP-A/α-tubulin的HeLa細胞系進行同步化后在有絲分裂期進行動態(tài)觀察，成功地觀察到了微管與著絲粒的動態(tài)變化過程。
　　5.通過比較GFP-CENP-A/α-tubulin的HeLa細胞與正常細胞的有絲分裂進程，提示兩者在細胞分裂時間上并無顯著性差別，提示該細胞的細

7、胞周期是正常的，因此可用于進一步的功能評價。
　　6.利用Time-Lapse活細胞工作站動態(tài)觀察了解聚藥加入及撤離細胞后，微管的重新生長過程，此結(jié)果表明GFP-CENP-A/α-tubulin已經(jīng)穩(wěn)定整合于HeLa細胞基因組中，提示該細胞可以作為開展針對微管的化療藥作用機制研究的強大工具。
　　結(jié)論：
　　成功構(gòu)建了慢病毒轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達標(biāo)記綠色熒光蛋白質(zhì)的著絲粒(GFP-CENP-A)與微管(GFP-α-tub uli