GFP-NSCs早期移植治療腦出血大鼠的最佳時(shí)間窗的研究.pdf

1、目的:
　　干細(xì)胞作為可能治療出血性腦卒中的方法之一，早期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)神經(jīng)干細(xì)胞移植可產(chǎn)生腦保護(hù)性作用，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，參與免疫調(diào)節(jié)，但其移植治療的最佳時(shí)間窗尚不清楚，還存在較大爭(zhēng)議。因此，本研究探討神經(jīng)干細(xì)胞(Neural stem cells，NSCs)早期原位移植入腦出血大鼠模型的最佳時(shí)間點(diǎn)。
　　方法:
　　(1)模型制作:選擇年輕雄性Sprague Dawley(SD)大鼠(280-320g)作為模型動(dòng)物，

2、利用腦立體定向儀向大鼠尾狀核注射Ⅳ型膠原酶建立腦出血模型。主要從以下三個(gè)方面來(lái)評(píng)價(jià)模型的穩(wěn)定性:腦組織解剖標(biāo)本冠狀面切片、MRI檢查、神經(jīng)功能行為學(xué)。解剖標(biāo)本和MRI檢查評(píng)價(jià)血腫的位置、大小和形態(tài)，神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)價(jià)大鼠神經(jīng)功能缺損的程度。
　　(2)NSCs培養(yǎng):鼠胚胎源性神經(jīng)干細(xì)胞原代購(gòu)于廣州賽業(yè)公司，培養(yǎng)傳代，利用相差顯微鏡觀(guān)察神經(jīng)干細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化形態(tài)，并行nestin免疫熒光染色鑒定神經(jīng)干細(xì)胞，用map2標(biāo)記神經(jīng)元及GF

3、AP標(biāo)記星形膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)鑒定神經(jīng)干細(xì)胞的分化能力。
　　(3)實(shí)驗(yàn)分組:A組單純腦出血組空白對(duì)照組(ICH+PBS)， B組神經(jīng)干細(xì)胞移植對(duì)照組(SHAM組SHAM)，C組神經(jīng)干細(xì)胞移植組(ICH+GFP-NSCs):分別在腦出血后3小時(shí)、1天、3天、5天、7天移植神經(jīng)干細(xì)胞。
　　(4)行為學(xué):觀(guān)察神經(jīng)干細(xì)胞移植對(duì)腦出血大鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)的影響。
　　(5)免疫熒光:應(yīng)用免疫熒光技術(shù)觀(guān)察神經(jīng)干細(xì)胞在腦出血大鼠腦內(nèi)NSC

4、移植前后的存活情況。
　　(6)ELASA:應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELASA)檢測(cè)腦出血和神經(jīng)干細(xì)胞移植后大鼠腦組織中相關(guān)細(xì)胞因子(bFGF、EGF、VEGF)的變化。
　　結(jié)果:
　　(1)Ⅳ膠原酶建立的腦出血模型腦內(nèi)血腫形態(tài)規(guī)則，血腫大小穩(wěn)定，邊界清楚，對(duì)側(cè)肢體功能障礙明顯。
　　(2)神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，增殖形成大量的神經(jīng)球，nestin染色陽(yáng)性證實(shí)為神經(jīng)干細(xì)胞，經(jīng)誘導(dǎo)分化后MAP-2和GFAP染色陽(yáng)性，

5、表明神經(jīng)干細(xì)胞可進(jìn)一步分化為神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。
　　(3)神經(jīng)干細(xì)胞移植治療腦出血大鼠后，可以促進(jìn)大鼠神經(jīng)功能缺損的恢復(fù)，以3天移植改善最為顯著。
　　(4)神經(jīng)干細(xì)胞原位移植治療腦出血大鼠，14天時(shí)，在顱內(nèi)可以檢測(cè)到存活的GFP-NSCs，其中3天移植組和5天移植組中，GFP-NSCs在形態(tài)上、數(shù)量上明顯占優(yōu)勢(shì)。
　　(5)GFP-NSCs原位移植增加了腦組織中大鼠堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、大鼠表皮生長(zhǎng)

6、因子(EGF)、大鼠血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)，其中3天移植治療組中， bFGF、EGF的表達(dá)顯著多于其他移植治療組，VEGF的表達(dá)在各治療組中無(wú)明顯差異。
　　(6)GFP-NSCs原位移植增加了腦組織中大鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、大鼠腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、大鼠睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)、大鼠膠質(zhì)細(xì)胞系來(lái)源的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)的表達(dá)，其中3天移植組中，上述四個(gè)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)水平顯著高于其他4個(gè)移植治