基于量子點標記抗核抗體檢測與CCP-AST細胞的測定研究.pdf

1、研究背景：
　　量子點(QDs)是近些年發(fā)展起來的一種新型納米材料，直徑在2～20nm，它具備一些傳統(tǒng)染料不可比擬的光電學優(yōu)勢，使其可以成為一類理想的生物熒光探針。比如QDs激發(fā)波長寬、發(fā)射波長窄，這樣使得可以用同一種波長的激發(fā)光同時激發(fā)多種不同量子點而發(fā)射出不同顏色的熒光；QDs的發(fā)射峰窄且對稱，重疊小，因此在檢測時不會出現(xiàn)互相干擾的問題；QDs具有尺寸效應，即通過調(diào)節(jié)QDs的大小和組成，可以產(chǎn)生不同發(fā)射波長的熒光，據(jù)此特性可以

2、根據(jù)研究需要合成任意粒徑的QDs；最后，QDs的熒光強度和穩(wěn)定性都很好，是普通熒光染料的100倍左右，幾乎沒有褪色現(xiàn)象。QDs在經(jīng)過各種化學修飾之后，生物相容性也非常好，并且對生物體危害小。因此將QDs用于生物熒光標記，在很多領域如醫(yī)學診斷、基因和蛋白質(zhì)的高通量分析，特別是在流式細胞術免疫分析、快速診斷增敏等方面都具有廣闊的應用前景。
　　研究目的：
　　構建基于QDs標記實驗診斷與分析技術平臺，包括用于抗核抗體(ANA)檢

3、測的間接免疫熒光法(IIFA)與環(huán)瓜氨酸肽抗原特異性T細胞(CCP/AST)的流式細胞術(FCM)。對其在ANA臨床樣本檢測、細胞成像中的效果進行評價，同時研究CCP/AST細胞在膠原誘導性關節(jié)炎(Collagen-induced arthritis，CIA)小鼠疾病發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　研究方法：
　　用2種粒徑不同的QDs制備QDs標記二抗[QDs-GAHIgG-F(ab’)2]或QDs標記鏈酶親合素(QDs-SA)，

4、分別用單色及多色QDs同時標記，采用間接免疫熒光法(IIFA)對臨床樣本ANA滴度進行檢測和表征成像，并與FITC標記二抗檢測結果進行比對。具體包括兩種ANA測定模式：(1)QDs標記IIFA兩步法：用QDs直接標記二抗對溫育標本直接進行熒光染色；(2)QDs標記IIFA-三步法：先行采用生物素化第二抗體與溫育標本結合，再用量子點標記QDs-SA進行熒光染色。同時，建立CIA小鼠模型，以QDs-SA結合生物素化CCP抗原肽，采用FCM檢

5、測CCP/AST細胞在CIA小鼠中陽性率，研究其與特異性T細胞增殖結果及與炎癥發(fā)生的關系。
　　研究結果：
　　1.經(jīng)對114例自身免疫病患者血清研究發(fā)現(xiàn)，兩種QDs標記二抗均可見與FITC標記二抗檢測ANA結果相同或類似的熒光模式，但ANA滴度略顯不同，對核顆粒型與胞漿顆粒型ANA測定靈敏度以QD655為最高，QD605次之，F(xiàn)ITC標記二抗相對較弱。而對核均質(zhì)型、核仁型與核著絲點型ANA測定靈敏度高低依次為FITC、QD

6、655和QD605標記二抗。相關分析結果顯示，兩種QDs與FITC標記物檢測ANA結果均呈高度正相關，r值分別為0.834、0.832(P均<0.01)。兩種QDs標記二抗對核顆粒型、胞漿顆粒型熒光模式與FITC標記二抗檢測結果陽性符合率均為100％；而核均質(zhì)與核仁型檢測結果，陽性結果符合率為80.6％～84.4％；30例用FITC標記二抗檢測ANA陰性血清中，兩種QDs標記二抗檢測均見有1例ANA陽性。兩種QDs與FITC標記物檢測A

7、NA總符合率均超過90.0％，有高度的一致性(Kappa值均>0.75)。
　　2.采用量子點標記鏈酶親合素(QD655-SA、QD605-SA、QD565-SA、QD525-SA)與生物素化二抗(Bio-GAHIgG)結合，對臨床樣本ANA進行檢測和細胞成像(IIFA三步法)，可獲得較FITC和QDs標記二抗檢測(IIFA兩步法)更為敏感和準確的實驗結果。除檢出有細胞核顆粒與細胞漿顆粒型ANA外，對細胞核仁型、核均質(zhì)型與核著絲點

8、型ANA熒光模式亦能敏感檢出。對臨床樣本和健康人對照組血清研究發(fā)現(xiàn)，QD655-SA、QD605-SA、QD565-SA與FITC標記檢測陽性結果符合率均為100％，陰性結果符合率均為96.7％，具有高度的結果一致性(Kappa值均>0.75)。與FITC標記檢測ANA結果滴度呈高度正相關，r值分別為0.900、0.882和0.938(P值均<0.01)。但QD525-SA檢測ANA應用效果不佳。兩種QDs聯(lián)合應用于ANA檢測，有助于區(qū)

9、分和展示不同細胞周期核內(nèi)靶抗原分布及可結合抗原-抗體復合物量的差異(因摻入熒光比例不同使得整個細胞核著染區(qū)分別呈紅色、亮黃色、黃綠色和墨綠色不等)，并可有效實施ANA檢測并對其水平做出合理評估。
　　3.本實驗在構建CIA小鼠模型的基礎上，采用QD705-SA結合Bio-CCP抗原肽對CCP特異性T細胞進行體外標記和FCM檢測，結果以CD4+CD8-CCP/TCR+為CCP/AST細胞陽性。研究結果發(fā)現(xiàn)，CIA模型組小鼠CCP/A

10、ST細胞陽性率(％)顯著高于對照組小鼠，分別為0.903±0.960和0.093±0.091，亦顯著高于模型組無關對照肽(PD2B)/AST細胞陽性率(0.149±0.099)，兩者間差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。相關分析結果顯示，CCP/AST細胞陽性率與CIA小鼠關節(jié)炎癥指數(shù)及用CCP抗原肽、抗CCP抗體、CCP/抗CCP抗體復合物刺激下淋巴細胞增殖結果均呈顯著的正相關關系r值分別為0.591、0.728、0.739和0.5

11、81(P<0.01或P<0.05)。提示CCP/AST細胞的存在與關節(jié)腫脹和炎癥程度關系密切。
　　結論：
　　基于QDs標記的IIFA檢測ANA總體結果穩(wěn)定、敏感、可信，QDs粒徑越大對ANA測定的敏感度越高。采用QDs標記鏈酶親合素-生物素系統(tǒng)對ANA進行IIFA檢測可獲得較FITC與QDs標記二抗更為敏感和準確的實驗結果。表征結果顯示多色量子點標記可區(qū)分和展示細胞核內(nèi)靶抗原定位分布及可結合抗原-抗體復合物量的差異，并能