白質(zhì)消融性白質(zhì)腦病和1型神經(jīng)纖維瘤病的分子診斷方法研究.pdf

1、本研究分三部分。第一部分建立了白質(zhì)消融性白質(zhì)腦病的分子診斷方法。白質(zhì)消融性白質(zhì)腦病(1eukoencepha1opathy with vanishing white matter，VWM)由真核細胞翻譯啟動因子2B(eukaryotic translation initiation factor2B，eIF2B)基因缺陷所致。eIF2B由eIF2Bα、eIF2Bβ、eIF2Bγ、eIF2Bδ、eIF2Bε5個亞單位組成，相應(yīng)編碼基因分別

2、為EIF2B1、EIF2B2、EIF2B3、EIF2B4、EIF2B5。本研究同時建立從外周血RNA途徑和DNA途徑檢測上述5個基因突變的方法，并應(yīng)用于一個臨床表現(xiàn)典型的VWM患者。結(jié)果顯示：RNA途徑僅在EIF2B5基因發(fā)現(xiàn)一呈雜合狀態(tài)的多態(tài)性位點c.2123A＞G(p.L587V)；DNA途徑在EIF2B2基因發(fā)現(xiàn)兩個堿基改變：intron3.c.515+43C＞A，c.1304G＞C，EIF2B3基因發(fā)現(xiàn)intron4.c.661

3、﹣35A＞G。
　　第二部分利用長鏈RT-PCR結(jié)合T克隆-測序的方法，發(fā)現(xiàn)人EIF2B4基因的一個新型可變剪接產(chǎn)物。在一個具有典型臨床表現(xiàn)的VWM患者外周血EIF2B4基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)一部分產(chǎn)物外顯子7的5'端缺失26bp，為一個可變剪接3’位點新型可變剪接產(chǎn)物。針對新發(fā)現(xiàn)的剪接位點，本研究對其它物種的 EIF2B4基因進行保守性分析，并對人EIF2B4基因可能的剪接變異體進行預(yù)測。結(jié)果顯示：人EIF2B4基因外顯子7的5'端

4、長26 bp與獼猴、黑猩猩、蘇門達臘猩猩、小鼠及大鼠之間具有相似的基因序列；生物信息學(xué)軟件均有預(yù)測到該可變剪接3’位點存在。同時，為檢測該可變剪接3’位點新型可變剪接產(chǎn)物，本研究對患者和正常人cDNA樣本進行巢式PCR擴增和PCR-限制性片段長度多態(tài)性分析。結(jié)果顯示：患者和正常人cDNA樣本均存在該新型可變剪接產(chǎn)物。
　　第三部分建立了1型神經(jīng)纖維瘤病的分子診斷方法，并分析其形成全身嵌合的1型神經(jīng)纖維瘤病的原因。1型神經(jīng)纖維瘤?。?/p>

5、neurofibromatosis type1，NF1）是最常見的常染色體顯性遺傳病。其致病基因為 NF1基因(NF1，NG_009018.1），定位于染色體17q11.2，由57個組成性外顯子和3個可變剪接外顯子組成。本研究通過提取一例散發(fā)1型神經(jīng)纖維瘤病病例的外周血RNA，PCR擴增NF1基因編碼區(qū)序列并進行序列測定；找到突變后，基因組DNA途徑證實突變。結(jié)果顯示：先證者檢測出無義突變c.7911C＞T(p.Q2510X)。為了對先

6、證者的NF1基因進行嵌合突變分析，本研究針對已發(fā)現(xiàn)的突變，取先證者全血淋巴細胞、口腔上皮細胞和尿路上皮細胞基因組DNA進行PCR擴增，其產(chǎn)物進行T克隆及測序。結(jié)果表明：該突變在外周血淋巴細胞、口腔上皮細胞和尿路上皮細胞呈嵌合狀態(tài)，含該突變的克隆數(shù)分別占總數(shù)的42％、36%、12%。
　　本研究不僅在國內(nèi)較早建立了白質(zhì)消融性白質(zhì)腦病和1型神經(jīng)纖維瘤病的分子診斷方法，而且發(fā)現(xiàn)了人EIF2B4基因的一個新型可變剪接產(chǎn)物，探討了新生突變所