不同血流動(dòng)力學(xué)狀態(tài)對(duì)肝臟熱缺血再灌注損傷的影響及干預(yù)研究.pdf

1、研究背景：
　　肝移植是治療許多終末期器質(zhì)性肝病唯一而有效的治療方法，但供體的缺乏使移植手術(shù)的適用范圍受到很大的限制。我國(guó)每年有30多萬(wàn)病人死于各種終末期肝病，每年急需肝移植挽救生命的患者眾多，而近年來(lái)，我國(guó)每年肝移植手術(shù)僅有2000例左右。美國(guó)器官移植的等待者和器官捐獻(xiàn)者的比例為5∶1，英國(guó)為3∶1，而中國(guó)高達(dá)150∶1。
　　由于缺乏自愿捐獻(xiàn)，中國(guó)此前絕大多數(shù)的移植器官來(lái)源于死囚捐獻(xiàn)。我國(guó)以死囚尸體為來(lái)源的供肝在國(guó)際上受

2、到爭(zhēng)議，并且有日趨減少的趨勢(shì)。而活體供體因涉及對(duì)供體有一定的損傷，故較難廣泛開(kāi)展。衛(wèi)生部副部長(zhǎng)黃潔夫近期表示，我國(guó)將盡快建立器官捐獻(xiàn)體系，公民逝世后器官捐獻(xiàn)應(yīng)該成為中國(guó)器官移植的主要來(lái)源，在3-5年內(nèi)改變主要依靠死囚來(lái)獲得移植器官的方式。
　　尸體供肝除來(lái)源于死囚供體外，還來(lái)源于公民逝世后的器官捐獻(xiàn)，包括心臟死亡供體(donors of cardiac death，DCD)和腦死亡供體（donors of brain death，

3、DBD）。雖然腦死亡供體的肝臟質(zhì)量較高，但我國(guó)目前腦死亡尚未立法，難以廣泛開(kāi)展腦死亡供體的肝移植。而心臟死亡供體的肝臟活力雖然可能有不同程度的下降，但現(xiàn)階段我國(guó)的醫(yī)學(xué)界和法律界仍以心臟死亡作為判斷死亡的主要標(biāo)準(zhǔn)，故來(lái)源于心臟死亡供體的供肝，雖只占目前我國(guó)供肝的較小部分，但卻是未來(lái)發(fā)展的重點(diǎn)和趨勢(shì)之一。公民心臟死亡后器官捐獻(xiàn)將逐步成為中國(guó)器官移植的主要來(lái)源。
　　1995年國(guó)際無(wú)心跳供體研討會(huì)制定了馬斯特里赫特(Maastricht

4、)分類標(biāo)準(zhǔn)，該標(biāo)準(zhǔn)將供體分為5類:Ⅰ類:入院時(shí)已死亡者，屬于“不可控制”型。Ⅱ類:心肺復(fù)蘇失敗者，屬于“不可控制”型。Ⅲ類:等待心臟停跳的瀕死者，未達(dá)到腦干死亡標(biāo)準(zhǔn)的即將死亡病人，治療無(wú)望的病人，預(yù)測(cè)撤除支持治療后短時(shí)間內(nèi)很快會(huì)發(fā)生心臟停跳，可見(jiàn)于神經(jīng)外科重癥監(jiān)護(hù)病房、一般重癥監(jiān)護(hù)病房、冠心病重癥監(jiān)護(hù)病房、創(chuàng)傷急診病房和一般病房的病人，屬于“可控制”型。Ⅳ類:病人在腦死亡的基礎(chǔ)上發(fā)生心跳驟停，屬于“可控制”型。Ⅴ類:危重病人發(fā)生意外的心

5、臟驟停，屬于“不可控制”型。衛(wèi)生部目前正在力推心臟死亡后器官捐贈(zèng)，已經(jīng)頒布了《中國(guó)心臟死亡器官捐獻(xiàn)指南》，倡導(dǎo)進(jìn)行第Ⅲ類供體的院內(nèi)器官捐獻(xiàn)。
　　心臟死亡供體的特點(diǎn)是供肝的熱缺血損傷較明顯，從撤除心肺支持設(shè)備到心跳停止、宣布死亡、切取肝臟，供體肝臟經(jīng)歷的熱缺血時(shí)間較長(zhǎng)，且常常經(jīng)歷多種不同的血流動(dòng)力學(xué)狀態(tài)，如低血壓、缺血、淤血等。臨床上迫切需要回答以下問(wèn)題:如何評(píng)估此類供肝的熱缺血損傷？如何減少供肝的熱缺血損傷？心臟死亡供體的原發(fā)病

6、不同，造成的血流動(dòng)力學(xué)改變不同，為此，有必要研究不同的血流動(dòng)力學(xué)狀態(tài)單獨(dú)對(duì)肝臟熱缺血再灌注損傷的影響，了解其內(nèi)在機(jī)制及干預(yù)因素。本研究即針對(duì)以上情況，借助大鼠肝臟熱缺血模型展開(kāi)。
　　肝臟缺血的本質(zhì)之一是缺氧，本實(shí)驗(yàn)選取了在組織缺氧損傷調(diào)控中扮演重要角色的缺氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）進(jìn)行研究，檢測(cè)不同的血流動(dòng)力學(xué)狀態(tài)下肝組織的HIF-1表達(dá)是否存在差異。通過(guò)使用干預(yù)HIF-1

7、活性的藥物，進(jìn)一步驗(yàn)證HIF-1在不同血流動(dòng)力學(xué)處理后肝臟熱缺血再灌注損傷中的作用。實(shí)驗(yàn)分為以下三個(gè)部分。
　　第一部分不同血流動(dòng)力學(xué)狀態(tài)對(duì)大鼠肝臟熱缺血再灌注損傷的影響
　　目的:對(duì)大鼠的部分肝臟進(jìn)行熱缺血處理，且針對(duì)該部分肝臟的不同血管（肝動(dòng)脈、門(mén)靜脈、肝靜脈）分別進(jìn)行阻斷，來(lái)研究不同血流動(dòng)力學(xué)狀態(tài)，對(duì)大鼠肝臟熱缺血再灌注損傷的影響。
　　方法:108只SD大鼠隨機(jī)分為3組:肝動(dòng)脈阻斷組(hepatic arter

8、y clamping group，HAC)、門(mén)靜脈阻斷組(hepatic portal vein clamping group，HPC)和肝靜脈阻斷組(hepatic veinclamping group，HVC)，按50％肝臟血流阻斷模型分別阻斷以上血管，按阻斷持續(xù)時(shí)間再分為15分鐘、30分鐘和60分鐘（共分為9小組，每小組n=12）。主要研究指標(biāo):①缺血不同時(shí)間后，進(jìn)行再灌注2小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)和48小時(shí)，檢測(cè)再灌注后

9、不同時(shí)間血清ALT變化（每小組n=6）;②缺血不同時(shí)間后，進(jìn)行再灌注6小時(shí)，檢測(cè)血管阻斷不同部位及時(shí)間對(duì)以下指標(biāo)的影響:血清ALT、TB，肝組織MPO和MDA含量（每小組n=6）;③缺血30分鐘后，進(jìn)行再灌注6小時(shí)，檢測(cè)不同血管阻斷對(duì)以下指標(biāo)的影響:肝組織病理學(xué)檢查，活體熒光顯微鏡觀察大鼠肝臟微循環(huán)狀態(tài)，Real-time PCR方法檢測(cè)肝組織TNF-α，IL-1，IL-6 mRNA，TUNEL法原位標(biāo)記肝細(xì)胞凋亡，ELISA檢測(cè)Cas

10、pase-3活性，Western blot方法檢測(cè)肝組織中凋亡相關(guān)蛋白（3小組，每小組n=6）;④所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)及單因素方差分析。
　　結(jié)果:本實(shí)驗(yàn)通過(guò)分別阻斷大鼠部分肝臟的肝動(dòng)脈、門(mén)靜脈分支和肝靜脈屬支，建立了不同類型的肝臟血流阻斷模型，模擬了心臟死亡供體肝臟常見(jiàn)的三種熱缺血血流動(dòng)力學(xué)狀態(tài):肝動(dòng)脈低氧，肝組織缺血和肝靜脈淤血。①三組大鼠肝臟經(jīng)歷不同時(shí)間熱缺血后，

11、血清ALT一般于再灌注后6小時(shí)達(dá)到峰值，此后逐漸下降;HVC組ALT顯著高于HAC組和HPC組(P＜0.01);②血管阻斷不同部位及時(shí)間對(duì)大鼠血清ALT、TB，肝組織MDA和MPO含量有明顯影響:HVC組熱缺血再灌注損傷程度較其他組明顯加重，血流阻斷60分鐘組各項(xiàng)指標(biāo)明顯差于15分鐘及30分鐘組(P＜0.05);③不同血管阻斷對(duì)以下指標(biāo)有影響:肝細(xì)胞壞死、肝竇無(wú)灌注比例、肝組織TNF-α，IL-1，IL-6 mRNA、肝細(xì)胞凋亡水平、C

12、aspase-3活性、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)等均存在較顯著差異，HVC組熱缺血再灌注損傷程度較其他組明顯加重（P＜0.05）。
　　結(jié)論:不同的肝臟血流動(dòng)力學(xué)缺血狀態(tài)及其持續(xù)時(shí)間，對(duì)其后繼再灌注損傷及其恢復(fù)有明顯不同的影響。熱缺血時(shí)間越長(zhǎng)，肝臟再灌注損傷越嚴(yán)重，這種損傷在再灌注較早期就迅速表現(xiàn)出來(lái)。大鼠肝臟熱缺血在不超過(guò)30分鐘時(shí)，損傷相對(duì)較小而可逆，而超過(guò)60分鐘后，損傷嚴(yán)重而較難逆轉(zhuǎn)。肝臟熱缺血時(shí)間最好控制30分鐘以內(nèi)。三組大鼠肝臟

13、熱缺血再灌注損傷存在較顯著差異，肝靜脈阻斷組損傷程度較其他組明顯加重。
　　第二部分不同血流動(dòng)力學(xué)狀態(tài)對(duì)大鼠肝臟HIF-1差異表達(dá)的影響
　　目的:觀察大鼠肝臟不同血管阻斷、熱缺血后，肝組織局部微循環(huán)、氧供、能量代謝的情況，并重點(diǎn)研究肝組織HIF-1α蛋白和HIF-1α mRNA表達(dá)、分布的特點(diǎn)，研究各組之間HIF-1α的差異。進(jìn)一步研究經(jīng)歷不同血流動(dòng)力學(xué)肝臟缺血再灌注后，各組大鼠肝功能和肝組織形態(tài)學(xué)改變的特點(diǎn)。
　　

14、方法:216只SD大鼠隨機(jī)分為3組:HAC組、HPC組、HVC組，按50％肝臟血流阻斷模型分別阻斷以上血管，按阻斷時(shí)間再分為15分鐘、30分鐘和60分鐘（共分為9小組，每小組n=24，另設(shè)假手術(shù)組作為對(duì)照，不阻斷血流）。主要研究指標(biāo):①缺血不同時(shí)間后即刻，取大鼠肝臟標(biāo)本，進(jìn)行HE染色病理學(xué)檢查;缺血后即刻，活體熒光顯微鏡觀察肝組織微循環(huán)情況;缺血后即刻，通過(guò)乏氧染色，檢測(cè)肝組織氧合狀態(tài)的變化及其分布特點(diǎn)，通過(guò)微透析法，檢測(cè)肝組織葡萄糖、

15、甘油糖原、乳酸和丙酮酸代謝水平（每小組n=6）;②肝臟缺血再灌注2小時(shí)后，Western blot和Real-time PCR的方法分別檢測(cè)肝組織HIF-1α蛋白和mRNA的表達(dá)水平，免疫組化方法對(duì)HIF-1α表達(dá)進(jìn)行組織定位，分析大鼠肝臟HIF-1α表達(dá)與缺氧、血管阻斷不同部位及時(shí)間的關(guān)系（每小組n=6）;③缺血再灌注6小時(shí)后和24小時(shí)后，測(cè)定大鼠肝功能、肝組織MPO活性的變化，觀察肝組織形態(tài)學(xué)的改變（每小組n=12）;④所得數(shù)據(jù)以均

16、數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)及單因素方差分析。
　　結(jié)果:①缺血后即刻，隨著血流阻斷時(shí)間的延長(zhǎng)，肝組織的損傷加劇，HAC組損傷較輕，而HVC組損傷較重，尤其是在經(jīng)過(guò)60分鐘的血流阻斷后，出現(xiàn)較明顯肝竇充血、肝細(xì)胞氣球樣變性和壞死;肝竇功能密度、肝竇內(nèi)紅細(xì)胞流速、肝組織血流等微循環(huán)指標(biāo)、肝組織氧合和葡萄糖、甘油糖原、乳酸/丙酮酸(lactate/pyruvate，L/P)比值等代謝指標(biāo)，HAC組優(yōu)于HPC組，HPC組優(yōu)于HV

17、C組（P＜0.05）;三組中肝組織乏氧染色陽(yáng)性分布特點(diǎn)不同，HAC組和HVC組陽(yáng)性染色集中于肝小葉中央靜脈周圍，HPC組集中于匯管區(qū)周圍;②在HAC組或HPC組，細(xì)胞核中HIF-1α蛋白量增加明顯(P＜0.05），在HVC組，肝組織中檢測(cè)到較少的HIF-1α蛋白，但其HIF-1αmRNA的表達(dá)出現(xiàn)了較明顯的增加;在各實(shí)驗(yàn)組中，HIF-1α蛋白染色的陽(yáng)性區(qū)域與乏氧染色的陽(yáng)性區(qū)域一致，表明缺氧是HIF-1α蛋白在細(xì)胞核內(nèi)聚集的觸發(fā)因素;③再

18、灌注后HVC組的損傷最重，在血流阻斷60分鐘、再灌注24小時(shí)后，HVC組肝組織出現(xiàn)了明顯的形態(tài)學(xué)改變，肝細(xì)胞的壞死嚴(yán)重而廣泛，呈現(xiàn)難以逆轉(zhuǎn)的改變:肝小葉結(jié)構(gòu)塌陷，肝竇充血，肝細(xì)胞變性;肝組織Suzuki評(píng)分HVC組最高（HAC、HPC、HVC組分別為0.83±0.04，2.21±0.59，3.89±0.08，各組間差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01）;再灌注24小時(shí)后，各組ALT回落，TB輕度升高，MPO降低。
　　結(jié)論:肝臟的

19、熱缺血損傷與肝組織缺氧有關(guān)。肝臟缺氧導(dǎo)致了肝組織的微循環(huán)障礙和能量代謝改變。肝臟缺氧誘導(dǎo)了在血流阻斷后再灌注早期，HIF-1α蛋白在細(xì)胞核內(nèi)的聚集，但由于肝腺泡的血流分布特點(diǎn)，HIF-1α蛋白在不同血流動(dòng)力學(xué)情況下，在各血流阻斷組的表達(dá)量及分布部位存在差異。HIF-1α蛋白對(duì)肝組織熱缺血再灌注損傷有保護(hù)作用，但對(duì)不同的血流動(dòng)力學(xué)熱缺血狀態(tài)其肝臟保護(hù)程度不同。
　　第三部分 HIF-1干預(yù)對(duì)大鼠肝臟熱缺血再灌注損傷的影響
　　

20、目的:通過(guò)2-甲氧基雌二醇(2-ME)抑制HIF-1α表達(dá)，觀察肝組織缺血再灌注損傷是否加重，2-ME干預(yù)對(duì)不同的血流動(dòng)力學(xué)缺血狀態(tài)肝臟的影響是否不同，進(jìn)一步驗(yàn)證HIF-1蛋白對(duì)肝臟熱缺血再灌注損傷的保護(hù)作用和調(diào)控機(jī)制。
　　方法:324只SD大鼠隨機(jī)分為3組:HAC組、HPC組、HVC組，按50％肝臟血流阻斷模型分別阻斷以上血管，按阻斷時(shí)間再分為15分鐘、30分鐘和60分鐘，以上各小組大鼠再分為2-ME干預(yù)組和未干預(yù)組，干預(yù)組血

21、流阻斷前腹腔內(nèi)注射2-ME，未干預(yù)組注射生理鹽水（每小組n=18）。主要研究指標(biāo):①檢測(cè)各組大鼠肝臟缺血30分鐘再灌注6小時(shí)和24小時(shí)后血清ALT、TB(n=12);②缺血30分鐘再灌注24小時(shí)后肝組織病理學(xué)檢查(n=6);③缺血15、30和60分鐘再灌注2小時(shí)后肝組織HIF-1α蛋白表達(dá)(n=6);④缺血15、30和60分鐘再灌注6小時(shí)后肝組織MPO和MDA含量(n=6);⑤缺血30分鐘再灌注24小時(shí)后Real-time PCR方法檢

22、測(cè)肝臟HO-1、eNOS、iNOS和A2AR mRNA表達(dá)(n=6)。⑥所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)及單因素方差分析。
　　結(jié)果:①2-ME干預(yù)減緩了各組大鼠缺血30分鐘再灌注6小時(shí)后ALT下降的趨勢(shì)，而加重了TB上升的趨勢(shì):干預(yù)后HAC組ALT由(218±10) U/L升高至(560±17) U/L，TB由(8.38±1.03) umol/L升高至(15.0±1.88) umol/L，HPC組ALT由(459

23、±7) U/L升高至(847±27) U/L，TB由(17.3±2.22) umol/L升高至(23.1±1.37) umol/L, P＜0.05;②2-ME干預(yù)加重了肝組織的熱缺血再灌注損傷的病理形態(tài)學(xué)改變;③在HAC組和HPC組，在2-ME干預(yù)后，發(fā)現(xiàn)了HIF-1α蛋白量的表達(dá)減少，P＜0.05。在HVC組，在2-ME干預(yù)后，HIF-1α蛋白量的表達(dá)有輕度增加;④2-ME干預(yù)后HAC組、HPC組MDA和MPO的含量升高了;⑤2-ME

24、干預(yù)后，各組大鼠肝組織HO-1、A2AR和iNOS mRNA的表達(dá)水平與未干預(yù)前比較，存在差異，尤其在HPC組和HVC組較明顯，P＜0.05;在各組中，eNOS mRNA的表達(dá)水平在2-ME干預(yù)前后變化不明顯。
　　結(jié)論:使用HIF-1α的抑制劑2-ME，加重了肝臟的熱缺血再灌注損傷，表現(xiàn)為肝功能變差，肝小葉結(jié)構(gòu)完整性變差，肝臟中MDA和MPO含量升高。2-ME干預(yù)后，肝組織HIF-1α蛋白表達(dá)減少;2-ME干預(yù)對(duì)HAC、HPC組