糖尿病腎病瘀血阻絡(luò)證大鼠腎皮質(zhì)ACE2-Ang-(1-7)-Aas軸的變化及化瘀通絡(luò)中藥的干預(yù)作用.pdf

1、目的:糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病(diabetesmellitus，DM)最常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥之一，是目前我國(guó)慢性腎衰竭的主要原因之一，探尋DN發(fā)病機(jī)制及有效防治措施的意義不言而喻。中醫(yī)藥在防控DN方面，已顯現(xiàn)出較大優(yōu)勢(shì)?，F(xiàn)代中醫(yī)腎病學(xué)者大多認(rèn)為，DN除有DM“氣陰兩虛”的病機(jī)外，其主要病機(jī)是瘀血阻于腎絡(luò)，DN治療多遵循活血化瘀通絡(luò)法則，已成為中醫(yī)腎病領(lǐng)域的共識(shí)。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)證實(shí)，腎素-血管緊張素系

2、統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)的激活是參與DN發(fā)病機(jī)制的主要因素，基于對(duì)DN過(guò)程中RAS經(jīng)典途徑ACE-AngⅡ-AT1通路過(guò)度激活的認(rèn)識(shí)，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(angiotensin convertingenzyme inhibitor，ACEI)、血管緊張素受體拮抗劑（angiotensin receptorblocker，ARB）已成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)臨床治療和延緩DM腎損害的一線藥物。然而，隨著對(duì)RAS

3、的深入研究發(fā)現(xiàn)，RAS的另一條功能軸——ACE2-Ang-(1-7)-Mas軸，可與ACE-AngⅡ-AT1軸相對(duì)抗。維持和調(diào)整RAS兩條代謝通路的平衡成為治療DM腎臟損傷的新理念。本研究擬以瘀血阻絡(luò)證候和ACE2-Ang-(1-7)-Mas軸為主要切入點(diǎn)，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及小鼠足細(xì)胞的離體培養(yǎng)，探索DN瘀血阻絡(luò)證是否與RAS中ACE2-Ang-(1-7)-Mas軸功能失調(diào)存在關(guān)聯(lián)，以及化瘀通絡(luò)中藥對(duì)DN瘀血阻絡(luò)證的干預(yù)作用是否同時(shí)改善AC

4、E2-Ang-(1-7)-Mas軸的功能失調(diào)。
　　方法:
　　1、糖尿病腎病大鼠瘀血阻絡(luò)證的確認(rèn)
　　健康雄性SD大鼠32只，4w齡，80～100g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1w后，隨機(jī)分為空白對(duì)照組（C組，n=8）、高糖高脂對(duì)照組（H組，n=10）和模型組（M組，n=14），C組大鼠予普通全價(jià)顆粒飼料喂養(yǎng)，其余大鼠均予高糖高脂飼料喂養(yǎng)。4w后，M組大鼠腹腔注射1％鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)溶液(40mg/

5、kg體重)，72h后隨機(jī)血糖＞16.7mmol/L為DM大鼠模型復(fù)制成功;C、H兩組大鼠均腹腔注射相應(yīng)體積的0.1M枸櫞酸緩沖液。于注射STZ后第3d、4w、8w、16w末，測(cè)量各組大鼠的隨機(jī)血糖。16w末收集大鼠24h尿液（檢測(cè)尿蛋白定量）后，麻醉狀態(tài)下腹主動(dòng)脈取血，檢測(cè)各組大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)、血脂和血小板參數(shù)，留取各組大鼠腎皮質(zhì)，行光鏡、透射電鏡觀察。
　　2、化瘀通絡(luò)中藥對(duì)糖尿病腎病大鼠瘀血阻絡(luò)證的干預(yù)作用
　　將實(shí)驗(yàn)

6、大鼠40只，隨機(jī)分為C組(n=10)和STZ注射組(n=30)。STZ注射組的模型復(fù)制方法同上。將模型復(fù)制成功的25只DM大鼠分為M組(n=12)和化瘀通絡(luò)中藥組（Z組，n=13）。用藥劑量按照成人臨床常用劑量的5.8倍計(jì)算，給予Z組大鼠中藥顆粒劑混懸液灌胃（1.08g/kg體重，相當(dāng)于飲片4.7g/kg體重），其余組大鼠給予相應(yīng)體積飲用水灌胃，每日1次，連續(xù)16w。16w末，腹主動(dòng)脈取血，檢測(cè)各組大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)、血脂、血小板參數(shù)、

7、血漿纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)含量(ELISA法)，并凍存部分腎皮質(zhì)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time PCR)檢測(cè)組織型纖溶酶原激活物(tissue plasminogen activator，t-PA)、纖溶酶原激活物抑制劑-1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)mRNA的表達(dá)。
　　3、糖尿病腎病瘀血阻絡(luò)證大鼠腎皮質(zhì)ACE2-Ang-(1-7)-Mas

8、軸的變化及化瘀通絡(luò)中藥的干預(yù)作用
　　將實(shí)驗(yàn)大鼠93只，隨機(jī)分為C組(n=22)和STZ注射組(n=71)，模型復(fù)制方法同上，將成模DM大鼠62只隨機(jī)分為M組(n=24)、厄貝沙坦組（I組，n=19）和Z組(n=19)，給予相應(yīng)藥物灌胃干預(yù)。于注射STZ后4w末隨機(jī)取C組、M組大鼠各6只處死，其余各組大鼠分別于8w、16w末分兩次處死，取腎皮質(zhì)組織，采用免疫組織化學(xué)法和蛋白印跡(western blot)檢測(cè)腎皮質(zhì)ACE2、Mas

9、、ACE蛋白的表達(dá)，real-time PCR檢測(cè)腎皮質(zhì)ACE2、Mas、ACE mRNA的表達(dá)，ELISA法檢測(cè)腎皮質(zhì)Ang-(1-7)的含量。
　　4、化瘀通絡(luò)中藥對(duì)糖尿病腎病瘀血阻絡(luò)證腎損傷的干預(yù)作用
　　將實(shí)驗(yàn)大鼠57只，隨機(jī)分為C組(n=10)和STZ注射組(n=47)，模型復(fù)制、成模DM大鼠分組及干預(yù)方法同上。于注射STZ后第3d、4w、8w、16w末，動(dòng)態(tài)計(jì)量各組大鼠體重、24h攝食量、飲水量、尿量和24h尿蛋

10、白定量。16w末處死動(dòng)物，腹主動(dòng)脈取血，檢測(cè)腎功能;稱量腎重，計(jì)算腎臟指數(shù)(kidney index，KI);留取腎皮質(zhì)，通過(guò)光鏡、透射電鏡檢測(cè)各組大鼠腎臟病理表現(xiàn)。
　　5、化瘀通絡(luò)中藥對(duì)高糖刺激下足細(xì)胞的干預(yù)作用
　　將許可條件下培養(yǎng)的條件性永生化小鼠足細(xì)胞分為正常糖組(NG組)、高糖組(HG組)和12個(gè)藥物濃度的高糖加藥組分別給予相應(yīng)干預(yù)24h、48h、72h，通過(guò)MTT試驗(yàn)觀察不同藥物濃度對(duì)高糖刺激下細(xì)胞增殖的影響，

11、對(duì)比結(jié)果篩選最佳藥物濃度。將非許可條件下分化成熟的小鼠足細(xì)胞分為NG組、HG組和最佳藥物濃度的高糖加藥組[HGG+Z）組]，分別給予相應(yīng)干預(yù)24h、48h、72h，檢測(cè)細(xì)胞上清液Ⅳ型膠原蛋白(collagen-Ⅳ，Col-Ⅳ)的含量;采用免疫細(xì)胞化學(xué)法和western blot檢測(cè)足細(xì)胞ACE和ACE2蛋白的表達(dá)，real-time PCR檢測(cè)足細(xì)胞ACE、ACE2mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1、糖尿病腎病大鼠瘀血阻絡(luò)

12、證的確認(rèn)
　　1.1一般情況
　　與C、H兩組大鼠比較，M組大鼠逐漸出現(xiàn)多飲、多食、多尿及體重降低的表現(xiàn)。C組大鼠爪心紅潤(rùn)，尾部靜脈暗紅不顯;H組與C組差異不明顯;而M組大鼠爪心紫暗，尾部靜脈深紫而清晰可見(jiàn)。
　　1.2隨機(jī)血糖
　　C、H兩組大鼠的血糖基本恒定，H組大鼠的血糖高于C組（P＜0.01）;腹腔注射STZ后，M組血糖水平顯著高于同時(shí)間點(diǎn)C、H兩組(P＜0.01)。
　　1.324h尿蛋白定量

13、r>　　16w末，C、H兩組間UPE無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);與C、H兩組比較，M組大鼠尿蛋白顯著增加(P＜0.01)。
　　1.4病理形態(tài)學(xué)
　　C、H兩組大鼠腎臟體積正常，表面光滑，腎小球結(jié)構(gòu)正常、清晰，足突排列整齊、無(wú)融合;M組大鼠腎臟體積增大，、表面不平滑且有蒼白花斑，腎小球腫脹肥大，基底膜均質(zhì)性增厚且結(jié)構(gòu)雜亂，系膜基質(zhì)增多，足突節(jié)段性融合。
　　1.5血液流變學(xué)指標(biāo)
　　16w末，H組僅紅細(xì)胞壓積(

14、hematocrit，HCT)低于C組(P＜0.05)。與C組比較，M組大鼠各切變率全血粘度、血漿粘度和全血低切還原粘度均明顯升高（P＜0.01），HCT、紅細(xì)胞變形指數(shù)(erythrocyte deformabilityindex，EDI)均明顯降低(P＜0.05或0.01);其中，全血粘度、血漿粘度和EDI還同時(shí)與H組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05或0.01)。
　　1.6血脂
　　16w末，H組血總膽固醇(total c

15、holesterol，TC)、低密度脂蛋白(lowdensity lipid cholesterol，LDL)和高密度脂蛋白（high density lipidcholesterol，HDL）均高于C組(P＜0.05或0.01)，而甘油三酯(triglyceride，TG)和極低密度脂蛋白(very low density lipid cholesterol，VLDL)則與C組無(wú)明顯差異(P＞0.05)。與C、H兩組比較，M組大鼠TC

16、、TG、LDL、HDL和VLDL均明顯升高(P＜0.01)。
　　1.7血小板參數(shù)
　　16w末，H組僅平均血小板體積(mean platelet volume，MPV)高于C組(P＜0.05)。與C組比較，M組血小板計(jì)數(shù)(platelet count，PLT)明顯減少(P＜0.01)，MPV和血小板分布寬度(platelet distributing width，PDW)顯著增高(P＜0.01);其中，PLT、MPV同時(shí)與

17、H組具有顯著差異(P＜0.05或0.01)。各組間大型血小板比率(platelet-large cell ratio，P-LCR)無(wú)明顯差異（P＞0.05）。
　　2、化瘀通絡(luò)中藥對(duì)糖尿病腎病大鼠瘀血阻絡(luò)證的干預(yù)作用
　　2.1一般情況
　　C組大鼠爪心紅潤(rùn)，尾部靜脈暗紅不顯;M組大鼠爪心紫暗，尾部靜脈深紫而清晰可見(jiàn);I、Z兩組大鼠爪心和尾部靜脈較M組有所改善。
　　2.2血液流變學(xué)指標(biāo)
　　16w末，與C

18、組比較，M組大鼠各切變率全血粘度、血漿粘度和全血低切還原粘度均明顯升高(P＜0.01)，HCT、紅細(xì)胞變形指數(shù)(erythrocytedeformability index，EDI)均明顯降低(P＜0.01);與M組比較，Z組切變率30S-1、200S-1全血粘度、血漿粘度和EDI均有顯著改善(P＜0.05或0.01)。
　　2.3血脂
　　16w末，與C組比較，M組大鼠TC、TG、LDL、HDL和VLDL均明顯升高(P＜0

19、.01)。與M組比較，Z組以上各血脂指標(biāo)均顯著降低(P＜0.05或0.01)。
　　2.4血小板參數(shù)
　　16w末，與C組比較，M組血小板計(jì)數(shù)(platelet count，PLT)明顯減少(P＜0.01)，MPV和血小板分布寬度(platelet distributing width，PDW)顯著增高(P＜0.05或0.01);與M組比較，Z組MPV、PDW均明顯降低(P＜0.01)。各組間大型血小板比率(platelet

20、-large cell ratio，P-LCR)無(wú)明顯差異（P＞0.05）。
　　2.5血漿FN含量
　　16w末，M組血漿FN含量明顯高于C組(P＜0.01);與M組比較，Z組含量明顯降低(P＜0.05)。
　　2.6腎皮質(zhì)t-PA、PAI-1 mRNA的表達(dá)
　　16w末，各組t-PA mRNA的表達(dá)無(wú)明顯差異（P＞0.05）;M組PAI-1mRNA的表達(dá)顯著高于C組(P＜0.05)，而Z組的表達(dá)低于M組(P

21、＜0.05)。
　　3、糖尿病腎病瘀血阻絡(luò)證大鼠腎皮質(zhì)ACE2-Ang-(1-7)-Mas軸的變化及化瘀通絡(luò)中藥的干預(yù)作用
　　3.1腎皮質(zhì)ACE2、Mas、ACE的表達(dá)
　　ACE2和ACE主要表達(dá)在各組大鼠腎小球和腎小管的上皮細(xì)胞中，Mas主要表達(dá)在各組大鼠腎皮質(zhì)組織的近端小管。
　　C組大鼠各時(shí)間點(diǎn)腎皮質(zhì)ACE2、Mas和ACE蛋白的表達(dá)均無(wú)顯著差異(P＞0.05)。M組大鼠腎皮質(zhì)ACE2、Mas蛋白的表達(dá)

22、均隨時(shí)間呈現(xiàn)降低趨勢(shì):16w末ACE2蛋白的表達(dá)低于4w末(P＜0.05);16w末Mas蛋白的表達(dá)分別低于4w末和8w末(P＜0.05或0.01)。M組不同時(shí)間點(diǎn)ACE蛋白的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　8w末，ACE2和Mas蛋白在各組大鼠腎皮質(zhì)組織的表達(dá)水平，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);ACE蛋白的表達(dá)水平僅在M、I兩組間存在差異(P＜0.05)。
　　16w末，腎皮質(zhì)ACE2蛋白的表達(dá)，M組低于C組(P＜

23、0.01), I、Z兩組均高于M組（P＜0.05），且Z組高于I組(P＜0.05); Mas蛋白的表達(dá)，M組低于C組(P＜0.05);I、Z兩組均高于M組(P＜0.01)。ACE蛋白的表達(dá)，M組顯著高于C組(P＜0.01);Z組低于M、I兩組(P＜0.05或0.01)。
　　3.2腎皮質(zhì)ACE2、Mas、ACE mRNA的表達(dá)
　　以4w末C組大鼠作為參照，進(jìn)行相對(duì)表達(dá)定量。C組大鼠各時(shí)間點(diǎn)腎皮質(zhì)ACE2、Mas、ACE m

24、RNA的表達(dá)無(wú)顯著差異(P＞0.05)。M組各時(shí)間點(diǎn)ACE2 mRNA的表達(dá)均低于同時(shí)間點(diǎn)C組(P＜0.01)，在4w至16w之間先上升(P＜0.01)、后下降(P＜0.05);M組Mas mRNA的表達(dá)在4w高于C組(P＜0.01)，在4w至16w之間持續(xù)下降(P＜0.01)，16w低于C組(P＜0.05);M組ACE mRNA的表達(dá)在4w低于C組(P＜0.01)，在4w至16w之間先上升(P＜0.01)、后下降(P＜0.05)，8w

25、、16w均高于C組(P＜0.05或0.01)。
　　8w末，各組Mas mRNA的表達(dá)無(wú)顯著差異(P＞0.05)。與C組比較，M組ACE2 mRNA的表達(dá)顯著降低(P＜0.01)，ACE mRNA的表達(dá)顯著升高(P＜0.01);與M組比較，Z組ACE2 mRNA的表達(dá)顯著升高(P＜0.01)，且高于I組（P＜0.05）;I、Z兩組ACE mRNA的表達(dá)均低于M組(P＜0.05)。
　　16w末，與C組比較，M組ACE2 mR

26、NA的表達(dá)顯著降低(P＜0.01)，ACE mRNA的表達(dá)顯著升高(P＜0.05)，而Mas mRNA的表達(dá)無(wú)顯著差異（P＞0.05）;與M組比較，Z組ACE2和Mas mRNA的表達(dá)均顯著升高(P＜0.05或0.01);其中，Z組Mas mRNA的表達(dá)還同時(shí)高于I組(P＜0.05);M、I、Z三組間ACE mRNA的表達(dá)差異不明顯(P＞0.05)。
　　3.3腎皮質(zhì)Ang-(1-7)的含量
　　16w末，與C組比較，M組大

27、鼠的腎皮質(zhì)Ang-(1-7)含量明顯降低(P＜0.01);而I、Z兩組的Ang-(1-7)含量均高于M組(P＜0.01)。
　　3.4 M組大鼠血液粘度與ACE2、Mas和ACE mRNA及其蛋白表達(dá)的線性相關(guān)分析
　　16w末，M組大鼠血漿粘度和不同切變率下全血粘度與腎皮質(zhì)ACE2mRNA及其蛋白的表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05或0.01)，與ACE mRNA及其蛋白的表達(dá)均呈正相關(guān)(P＜0.05或0.01);而與Mas m

28、RNA及其蛋白的表達(dá)無(wú)顯著線性相關(guān)關(guān)系(P＞0.05)。
　　4、化瘀通絡(luò)中藥對(duì)糖尿病腎病瘀血阻絡(luò)證腎損傷的干預(yù)作用
　　4.1糖尿病癥狀性指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化
　　腹腔注射STZ4w后，M組大鼠各時(shí)間點(diǎn)體重均明顯低于同時(shí)間點(diǎn)C組(P＜0.01);16w末，I、Z兩組體重均明顯高于M組(P＜0.05或0.01)。與同時(shí)間點(diǎn)C組比較，M組各時(shí)間點(diǎn)RBG、24h攝食熱量、飲水量和尿量均顯著升高(P＜0.01);與同時(shí)間點(diǎn)M組比較

29、，I、Z兩組各時(shí)間點(diǎn)RBG、24h攝食熱量和尿量均無(wú)明顯差異(P＞0.05)，僅8w末I、Z兩組和16w末Z組24h飲水量顯著低于同時(shí)間點(diǎn)M組(P＜0.05或0.01)。
　　4.224h尿蛋白定量的動(dòng)態(tài)變化
　　M組大鼠各時(shí)間點(diǎn)尿蛋白均高于同時(shí)間點(diǎn)C組(P＜0.01);8w末，I、Z兩組尿蛋白明顯低于M組(P＜0.05或0.01);16w末，Z組顯著低于M、I兩組(P＜0.05或0.01)。
　　4.3腎功能

30、　　16w末，M組血肌酐(serum creatinine，Scr)、尿素氮(blood ureanitrogen，BUN)、尿酸(uric acid，UA)均高于C組(P＜0.01);與M組比較，I、Z兩組Scr、BUN均有顯著改善(P＜0.05或0.01)，Z組UA也低于M組(P＜0.05)。
　　4.4腎臟指數(shù)
　　16w末，M組KI值明顯高于C組(P＜0.01);而I、Z兩組KI值均顯著低于M組(P＜0.05)。

31、r>　　4.5光鏡觀察腎皮質(zhì)結(jié)構(gòu)
　　C組腎皮質(zhì)結(jié)構(gòu)正常;M組腎小球腎小球體積肥大，基底膜輕度增厚，系膜輕度增生，毛細(xì)血管管腔擴(kuò)張，腎小囊腔狹窄，腎小管上皮細(xì)胞排列紊亂、肥大;I、Z兩組的腎小囊腔較寬，系膜增生有所改善。
　　4.6透射電鏡觀察腎小球超微結(jié)構(gòu)
　　C組腎小球超微結(jié)構(gòu)基本正常;M組大鼠腎小球基底膜均質(zhì)性增厚且結(jié)構(gòu)欠清晰，系膜基質(zhì)增多，足突節(jié)段性融合;I、Z兩組結(jié)構(gòu)較清晰，基底膜節(jié)段性增厚，足突少部分融合。

32、
　　5、化瘀通絡(luò)中藥對(duì)高糖刺激下足細(xì)胞的干預(yù)作用
　　5.1 MTT試驗(yàn)
　　HG組各時(shí)間點(diǎn)光密度（optical density，OD）值均明顯低于同時(shí)間點(diǎn)NG組(P＜0.05或0.01);多個(gè)藥物濃度均對(duì)高糖刺激24h、48h、72h對(duì)足細(xì)胞的增殖抑制有不同程度的逆轉(zhuǎn)作用，其中，各時(shí)間點(diǎn)均以藥物濃度100ug/ml的含藥高糖組的OD值最高，且高于HG組(P＜0.01)。以100ug/ml作為最佳給藥濃度。

33、　　5.2細(xì)胞上清液Col-Ⅳ的含量
　　給予足細(xì)胞不同干預(yù)24h后，各組細(xì)胞上清液Col-Ⅳ的含量無(wú)顯著差異(P＞0.05);不同干預(yù)48h、72h后，HG組細(xì)胞上清液Col-Ⅳ的含量均高于同時(shí)間點(diǎn)NG組(P＜0.01)，而(HG+Z)組干預(yù)48h后Col-Ⅳ的含量顯著低于HG組(P＜0.05)。
　　5.3足細(xì)胞ACE、ACE2蛋白的表達(dá)
　　ACE和ACE2蛋白特異性表達(dá)于足細(xì)胞胞漿中。不同干預(yù)48h，與NG組比

34、較，HG組ACE蛋白表達(dá)顯著升高(P＜0.05)，ACE2蛋白表達(dá)顯著降低(P＜0.01);與HG組比較，（HG+Z）組ACE蛋白表達(dá)較低，而ACE2蛋白表達(dá)較高(P＜0.05)。而不同干預(yù)24h、72h后，各組ACE2、ACE蛋白的表達(dá)均無(wú)明顯差異（P＞0.05）。
　　5.4足細(xì)胞ACE、ACE2 mRNA的表達(dá)
　　分別與同時(shí)間點(diǎn)NG組比較，HG組各時(shí)間點(diǎn)ACE mRNA表達(dá)均顯著升高（P＜0.05），HG組24h、4

35、8h ACE2 mRNA表達(dá)顯著降低(P＜0.05或0.01);分別與同時(shí)間點(diǎn)HG組比較，僅48h(HG+Z)組ACE mRNA表達(dá)明顯降低，ACE2 mRNA表達(dá)明顯升高(P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　1、DN大鼠爪掌、尾靜脈有紫暗瘀血表現(xiàn)，血液存在高粘、高凝狀態(tài)，與瘀血阻絡(luò)的中醫(yī)證候特征相符，確認(rèn)了DN瘀血阻絡(luò)證的存在。
　　2、化瘀通絡(luò)中藥對(duì)DN大鼠瘀血阻于腎絡(luò)的證候具有良性調(diào)節(jié)作用。
　　3、DN大鼠