糖尿病腎病瘀血阻絡證大鼠腎皮質(zhì)ACE2-Ang-(1-7)-Aas軸的變化及化瘀通絡中藥的干預作用.pdf

1、目的:糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病(diabetesmellitus，DM)最常見的微血管并發(fā)癥之一，是目前我國慢性腎衰竭的主要原因之一，探尋DN發(fā)病機制及有效防治措施的意義不言而喻。中醫(yī)藥在防控DN方面，已顯現(xiàn)出較大優(yōu)勢?，F(xiàn)代中醫(yī)腎病學者大多認為，DN除有DM“氣陰兩虛”的病機外，其主要病機是瘀血阻于腎絡，DN治療多遵循活血化瘀通絡法則，已成為中醫(yī)腎病領(lǐng)域的共識?，F(xiàn)代醫(yī)學證實，腎素-血管緊張素系

2、統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)的激活是參與DN發(fā)病機制的主要因素，基于對DN過程中RAS經(jīng)典途徑ACE-AngⅡ-AT1通路過度激活的認識，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(angiotensin convertingenzyme inhibitor，ACEI)、血管緊張素受體拮抗劑（angiotensin receptorblocker，ARB）已成為現(xiàn)代醫(yī)學臨床治療和延緩DM腎損害的一線藥物。然而，隨著對RAS

3、的深入研究發(fā)現(xiàn)，RAS的另一條功能軸——ACE2-Ang-(1-7)-Mas軸，可與ACE-AngⅡ-AT1軸相對抗。維持和調(diào)整RAS兩條代謝通路的平衡成為治療DM腎臟損傷的新理念。本研究擬以瘀血阻絡證候和ACE2-Ang-(1-7)-Mas軸為主要切入點，通過動物實驗及小鼠足細胞的離體培養(yǎng)，探索DN瘀血阻絡證是否與RAS中ACE2-Ang-(1-7)-Mas軸功能失調(diào)存在關(guān)聯(lián)，以及化瘀通絡中藥對DN瘀血阻絡證的干預作用是否同時改善AC

4、E2-Ang-(1-7)-Mas軸的功能失調(diào)。
　　方法:
　　1、糖尿病腎病大鼠瘀血阻絡證的確認
　　健康雄性SD大鼠32只，4w齡，80～100g，適應性喂養(yǎng)1w后，隨機分為空白對照組（C組，n=8）、高糖高脂對照組（H組，n=10）和模型組（M組，n=14），C組大鼠予普通全價顆粒飼料喂養(yǎng)，其余大鼠均予高糖高脂飼料喂養(yǎng)。4w后，M組大鼠腹腔注射1％鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)溶液(40mg/

5、kg體重)，72h后隨機血糖＞16.7mmol/L為DM大鼠模型復制成功;C、H兩組大鼠均腹腔注射相應體積的0.1M枸櫞酸緩沖液。于注射STZ后第3d、4w、8w、16w末，測量各組大鼠的隨機血糖。16w末收集大鼠24h尿液（檢測尿蛋白定量）后，麻醉狀態(tài)下腹主動脈取血，檢測各組大鼠血液流變學指標、血脂和血小板參數(shù)，留取各組大鼠腎皮質(zhì)，行光鏡、透射電鏡觀察。
　　2、化瘀通絡中藥對糖尿病腎病大鼠瘀血阻絡證的干預作用
　　將實驗

6、大鼠40只，隨機分為C組(n=10)和STZ注射組(n=30)。STZ注射組的模型復制方法同上。將模型復制成功的25只DM大鼠分為M組(n=12)和化瘀通絡中藥組（Z組，n=13）。用藥劑量按照成人臨床常用劑量的5.8倍計算，給予Z組大鼠中藥顆粒劑混懸液灌胃（1.08g/kg體重，相當于飲片4.7g/kg體重），其余組大鼠給予相應體積飲用水灌胃，每日1次，連續(xù)16w。16w末，腹主動脈取血，檢測各組大鼠血液流變學指標、血脂、血小板參數(shù)、

7、血漿纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)含量(ELISA法)，并凍存部分腎皮質(zhì)，采用實時熒光定量PCR(real-time PCR)檢測組織型纖溶酶原激活物(tissue plasminogen activator，t-PA)、纖溶酶原激活物抑制劑-1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)mRNA的表達。
　　3、糖尿病腎病瘀血阻絡證大鼠腎皮質(zhì)ACE2-Ang-(1-7)-Mas

8、軸的變化及化瘀通絡中藥的干預作用
　　將實驗大鼠93只，隨機分為C組(n=22)和STZ注射組(n=71)，模型復制方法同上，將成模DM大鼠62只隨機分為M組(n=24)、厄貝沙坦組（I組，n=19）和Z組(n=19)，給予相應藥物灌胃干預。于注射STZ后4w末隨機取C組、M組大鼠各6只處死，其余各組大鼠分別于8w、16w末分兩次處死，取腎皮質(zhì)組織，采用免疫組織化學法和蛋白印跡(western blot)檢測腎皮質(zhì)ACE2、Mas

9、、ACE蛋白的表達，real-time PCR檢測腎皮質(zhì)ACE2、Mas、ACE mRNA的表達，ELISA法檢測腎皮質(zhì)Ang-(1-7)的含量。
　　4、化瘀通絡中藥對糖尿病腎病瘀血阻絡證腎損傷的干預作用
　　將實驗大鼠57只，隨機分為C組(n=10)和STZ注射組(n=47)，模型復制、成模DM大鼠分組及干預方法同上。于注射STZ后第3d、4w、8w、16w末，動態(tài)計量各組大鼠體重、24h攝食量、飲水量、尿量和24h尿蛋

10、白定量。16w末處死動物，腹主動脈取血，檢測腎功能;稱量腎重，計算腎臟指數(shù)(kidney index，KI);留取腎皮質(zhì)，通過光鏡、透射電鏡檢測各組大鼠腎臟病理表現(xiàn)。
　　5、化瘀通絡中藥對高糖刺激下足細胞的干預作用
　　將許可條件下培養(yǎng)的條件性永生化小鼠足細胞分為正常糖組(NG組)、高糖組(HG組)和12個藥物濃度的高糖加藥組分別給予相應干預24h、48h、72h，通過MTT試驗觀察不同藥物濃度對高糖刺激下細胞增殖的影響，

11、對比結(jié)果篩選最佳藥物濃度。將非許可條件下分化成熟的小鼠足細胞分為NG組、HG組和最佳藥物濃度的高糖加藥組[HGG+Z）組]，分別給予相應干預24h、48h、72h，檢測細胞上清液Ⅳ型膠原蛋白(collagen-Ⅳ，Col-Ⅳ)的含量;采用免疫細胞化學法和western blot檢測足細胞ACE和ACE2蛋白的表達，real-time PCR檢測足細胞ACE、ACE2mRNA的表達。
　　結(jié)果:
　　1、糖尿病腎病大鼠瘀血阻絡

12、證的確認
　　1.1一般情況
　　與C、H兩組大鼠比較，M組大鼠逐漸出現(xiàn)多飲、多食、多尿及體重降低的表現(xiàn)。C組大鼠爪心紅潤，尾部靜脈暗紅不顯;H組與C組差異不明顯;而M組大鼠爪心紫暗，尾部靜脈深紫而清晰可見。
　　1.2隨機血糖
　　C、H兩組大鼠的血糖基本恒定，H組大鼠的血糖高于C組（P＜0.01）;腹腔注射STZ后，M組血糖水平顯著高于同時間點C、H兩組(P＜0.01)。
　　1.324h尿蛋白定量

13、r>　　16w末，C、H兩組間UPE無統(tǒng)計學差異(P＞0.05);與C、H兩組比較，M組大鼠尿蛋白顯著增加(P＜0.01)。
　　1.4病理形態(tài)學
　　C、H兩組大鼠腎臟體積正常，表面光滑，腎小球結(jié)構(gòu)正常、清晰，足突排列整齊、無融合;M組大鼠腎臟體積增大，、表面不平滑且有蒼白花斑，腎小球腫脹肥大，基底膜均質(zhì)性增厚且結(jié)構(gòu)雜亂，系膜基質(zhì)增多，足突節(jié)段性融合。
　　1.5血液流變學指標
　　16w末，H組僅紅細胞壓積(

14、hematocrit，HCT)低于C組(P＜0.05)。與C組比較，M組大鼠各切變率全血粘度、血漿粘度和全血低切還原粘度均明顯升高（P＜0.01），HCT、紅細胞變形指數(shù)(erythrocyte deformabilityindex，EDI)均明顯降低(P＜0.05或0.01);其中，全血粘度、血漿粘度和EDI還同時與H組具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05或0.01)。
　　1.6血脂
　　16w末，H組血總膽固醇(total c

15、holesterol，TC)、低密度脂蛋白(lowdensity lipid cholesterol，LDL)和高密度脂蛋白（high density lipidcholesterol，HDL）均高于C組(P＜0.05或0.01)，而甘油三酯(triglyceride，TG)和極低密度脂蛋白(very low density lipid cholesterol，VLDL)則與C組無明顯差異(P＞0.05)。與C、H兩組比較，M組大鼠TC

16、、TG、LDL、HDL和VLDL均明顯升高(P＜0.01)。
　　1.7血小板參數(shù)
　　16w末，H組僅平均血小板體積(mean platelet volume，MPV)高于C組(P＜0.05)。與C組比較，M組血小板計數(shù)(platelet count，PLT)明顯減少(P＜0.01)，MPV和血小板分布寬度(platelet distributing width，PDW)顯著增高(P＜0.01);其中，PLT、MPV同時與

17、H組具有顯著差異(P＜0.05或0.01)。各組間大型血小板比率(platelet-large cell ratio，P-LCR)無明顯差異（P＞0.05）。
　　2、化瘀通絡中藥對糖尿病腎病大鼠瘀血阻絡證的干預作用
　　2.1一般情況
　　C組大鼠爪心紅潤，尾部靜脈暗紅不顯;M組大鼠爪心紫暗，尾部靜脈深紫而清晰可見;I、Z兩組大鼠爪心和尾部靜脈較M組有所改善。
　　2.2血液流變學指標
　　16w末，與C

18、組比較，M組大鼠各切變率全血粘度、血漿粘度和全血低切還原粘度均明顯升高(P＜0.01)，HCT、紅細胞變形指數(shù)(erythrocytedeformability index，EDI)均明顯降低(P＜0.01);與M組比較，Z組切變率30S-1、200S-1全血粘度、血漿粘度和EDI均有顯著改善(P＜0.05或0.01)。
　　2.3血脂
　　16w末，與C組比較，M組大鼠TC、TG、LDL、HDL和VLDL均明顯升高(P＜0

19、.01)。與M組比較，Z組以上各血脂指標均顯著降低(P＜0.05或0.01)。
　　2.4血小板參數(shù)
　　16w末，與C組比較，M組血小板計數(shù)(platelet count，PLT)明顯減少(P＜0.01)，MPV和血小板分布寬度(platelet distributing width，PDW)顯著增高(P＜0.05或0.01);與M組比較，Z組MPV、PDW均明顯降低(P＜0.01)。各組間大型血小板比率(platelet

20、-large cell ratio，P-LCR)無明顯差異（P＞0.05）。
　　2.5血漿FN含量
　　16w末，M組血漿FN含量明顯高于C組(P＜0.01);與M組比較，Z組含量明顯降低(P＜0.05)。
　　2.6腎皮質(zhì)t-PA、PAI-1 mRNA的表達
　　16w末，各組t-PA mRNA的表達無明顯差異（P＞0.05）;M組PAI-1mRNA的表達顯著高于C組(P＜0.05)，而Z組的表達低于M組(P

21、＜0.05)。
　　3、糖尿病腎病瘀血阻絡證大鼠腎皮質(zhì)ACE2-Ang-(1-7)-Mas軸的變化及化瘀通絡中藥的干預作用
　　3.1腎皮質(zhì)ACE2、Mas、ACE的表達
　　ACE2和ACE主要表達在各組大鼠腎小球和腎小管的上皮細胞中，Mas主要表達在各組大鼠腎皮質(zhì)組織的近端小管。
　　C組大鼠各時間點腎皮質(zhì)ACE2、Mas和ACE蛋白的表達均無顯著差異(P＞0.05)。M組大鼠腎皮質(zhì)ACE2、Mas蛋白的表達

22、均隨時間呈現(xiàn)降低趨勢:16w末ACE2蛋白的表達低于4w末(P＜0.05);16w末Mas蛋白的表達分別低于4w末和8w末(P＜0.05或0.01)。M組不同時間點ACE蛋白的表達無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　8w末，ACE2和Mas蛋白在各組大鼠腎皮質(zhì)組織的表達水平，無統(tǒng)計學差異(P＞0.05);ACE蛋白的表達水平僅在M、I兩組間存在差異(P＜0.05)。
　　16w末，腎皮質(zhì)ACE2蛋白的表達，M組低于C組(P＜

23、0.01), I、Z兩組均高于M組（P＜0.05），且Z組高于I組(P＜0.05); Mas蛋白的表達，M組低于C組(P＜0.05);I、Z兩組均高于M組(P＜0.01)。ACE蛋白的表達，M組顯著高于C組(P＜0.01);Z組低于M、I兩組(P＜0.05或0.01)。
　　3.2腎皮質(zhì)ACE2、Mas、ACE mRNA的表達
　　以4w末C組大鼠作為參照，進行相對表達定量。C組大鼠各時間點腎皮質(zhì)ACE2、Mas、ACE m

24、RNA的表達無顯著差異(P＞0.05)。M組各時間點ACE2 mRNA的表達均低于同時間點C組(P＜0.01)，在4w至16w之間先上升(P＜0.01)、后下降(P＜0.05);M組Mas mRNA的表達在4w高于C組(P＜0.01)，在4w至16w之間持續(xù)下降(P＜0.01)，16w低于C組(P＜0.05);M組ACE mRNA的表達在4w低于C組(P＜0.01)，在4w至16w之間先上升(P＜0.01)、后下降(P＜0.05)，8w

25、、16w均高于C組(P＜0.05或0.01)。
　　8w末，各組Mas mRNA的表達無顯著差異(P＞0.05)。與C組比較，M組ACE2 mRNA的表達顯著降低(P＜0.01)，ACE mRNA的表達顯著升高(P＜0.01);與M組比較，Z組ACE2 mRNA的表達顯著升高(P＜0.01)，且高于I組（P＜0.05）;I、Z兩組ACE mRNA的表達均低于M組(P＜0.05)。
　　16w末，與C組比較，M組ACE2 mR

26、NA的表達顯著降低(P＜0.01)，ACE mRNA的表達顯著升高(P＜0.05)，而Mas mRNA的表達無顯著差異（P＞0.05）;與M組比較，Z組ACE2和Mas mRNA的表達均顯著升高(P＜0.05或0.01);其中，Z組Mas mRNA的表達還同時高于I組(P＜0.05);M、I、Z三組間ACE mRNA的表達差異不明顯(P＞0.05)。
　　3.3腎皮質(zhì)Ang-(1-7)的含量
　　16w末，與C組比較，M組大

27、鼠的腎皮質(zhì)Ang-(1-7)含量明顯降低(P＜0.01);而I、Z兩組的Ang-(1-7)含量均高于M組(P＜0.01)。
　　3.4 M組大鼠血液粘度與ACE2、Mas和ACE mRNA及其蛋白表達的線性相關(guān)分析
　　16w末，M組大鼠血漿粘度和不同切變率下全血粘度與腎皮質(zhì)ACE2mRNA及其蛋白的表達均呈負相關(guān)(P＜0.05或0.01)，與ACE mRNA及其蛋白的表達均呈正相關(guān)(P＜0.05或0.01);而與Mas m

28、RNA及其蛋白的表達無顯著線性相關(guān)關(guān)系(P＞0.05)。
　　4、化瘀通絡中藥對糖尿病腎病瘀血阻絡證腎損傷的干預作用
　　4.1糖尿病癥狀性指標的動態(tài)變化
　　腹腔注射STZ4w后，M組大鼠各時間點體重均明顯低于同時間點C組(P＜0.01);16w末，I、Z兩組體重均明顯高于M組(P＜0.05或0.01)。與同時間點C組比較，M組各時間點RBG、24h攝食熱量、飲水量和尿量均顯著升高(P＜0.01);與同時間點M組比較

29、，I、Z兩組各時間點RBG、24h攝食熱量和尿量均無明顯差異(P＞0.05)，僅8w末I、Z兩組和16w末Z組24h飲水量顯著低于同時間點M組(P＜0.05或0.01)。
　　4.224h尿蛋白定量的動態(tài)變化
　　M組大鼠各時間點尿蛋白均高于同時間點C組(P＜0.01);8w末，I、Z兩組尿蛋白明顯低于M組(P＜0.05或0.01);16w末，Z組顯著低于M、I兩組(P＜0.05或0.01)。
　　4.3腎功能

30、　　16w末，M組血肌酐(serum creatinine，Scr)、尿素氮(blood ureanitrogen，BUN)、尿酸(uric acid，UA)均高于C組(P＜0.01);與M組比較，I、Z兩組Scr、BUN均有顯著改善(P＜0.05或0.01)，Z組UA也低于M組(P＜0.05)。
　　4.4腎臟指數(shù)
　　16w末，M組KI值明顯高于C組(P＜0.01);而I、Z兩組KI值均顯著低于M組(P＜0.05)。

31、r>　　4.5光鏡觀察腎皮質(zhì)結(jié)構(gòu)
　　C組腎皮質(zhì)結(jié)構(gòu)正常;M組腎小球腎小球體積肥大，基底膜輕度增厚，系膜輕度增生，毛細血管管腔擴張，腎小囊腔狹窄，腎小管上皮細胞排列紊亂、肥大;I、Z兩組的腎小囊腔較寬，系膜增生有所改善。
　　4.6透射電鏡觀察腎小球超微結(jié)構(gòu)
　　C組腎小球超微結(jié)構(gòu)基本正常;M組大鼠腎小球基底膜均質(zhì)性增厚且結(jié)構(gòu)欠清晰，系膜基質(zhì)增多，足突節(jié)段性融合;I、Z兩組結(jié)構(gòu)較清晰，基底膜節(jié)段性增厚，足突少部分融合。

32、
　　5、化瘀通絡中藥對高糖刺激下足細胞的干預作用
　　5.1 MTT試驗
　　HG組各時間點光密度（optical density，OD）值均明顯低于同時間點NG組(P＜0.05或0.01);多個藥物濃度均對高糖刺激24h、48h、72h對足細胞的增殖抑制有不同程度的逆轉(zhuǎn)作用，其中，各時間點均以藥物濃度100ug/ml的含藥高糖組的OD值最高，且高于HG組(P＜0.01)。以100ug/ml作為最佳給藥濃度。

33、　　5.2細胞上清液Col-Ⅳ的含量
　　給予足細胞不同干預24h后，各組細胞上清液Col-Ⅳ的含量無顯著差異(P＞0.05);不同干預48h、72h后，HG組細胞上清液Col-Ⅳ的含量均高于同時間點NG組(P＜0.01)，而(HG+Z)組干預48h后Col-Ⅳ的含量顯著低于HG組(P＜0.05)。
　　5.3足細胞ACE、ACE2蛋白的表達
　　ACE和ACE2蛋白特異性表達于足細胞胞漿中。不同干預48h，與NG組比

34、較，HG組ACE蛋白表達顯著升高(P＜0.05)，ACE2蛋白表達顯著降低(P＜0.01);與HG組比較，（HG+Z）組ACE蛋白表達較低，而ACE2蛋白表達較高(P＜0.05)。而不同干預24h、72h后，各組ACE2、ACE蛋白的表達均無明顯差異（P＞0.05）。
　　5.4足細胞ACE、ACE2 mRNA的表達
　　分別與同時間點NG組比較，HG組各時間點ACE mRNA表達均顯著升高（P＜0.05），HG組24h、4

35、8h ACE2 mRNA表達顯著降低(P＜0.05或0.01);分別與同時間點HG組比較，僅48h(HG+Z)組ACE mRNA表達明顯降低，ACE2 mRNA表達明顯升高(P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　1、DN大鼠爪掌、尾靜脈有紫暗瘀血表現(xiàn)，血液存在高粘、高凝狀態(tài)，與瘀血阻絡的中醫(yī)證候特征相符，確認了DN瘀血阻絡證的存在。
　　2、化瘀通絡中藥對DN大鼠瘀血阻于腎絡的證候具有良性調(diào)節(jié)作用。
　　3、DN大鼠