復方苦參注射液干預BMSCs與乳腺癌細胞交互作用機理的體外實驗研究.pdf

1、流行病學顯示：在中國，每年乳腺癌的發(fā)病率增加3％。是世界上癌癥的最高增幅，中國首個大規(guī)模乳腺癌流行病調(diào)研項目“中國乳腺癌流行病學調(diào)研項目”中國女性乳腺癌患者的發(fā)病年齡跨度從20歲到70余歲，其中40歲到49歲年齡段是發(fā)病高峰期，發(fā)病的中位年齡為48歲，比西方提早了十年。乳腺癌的復發(fā)和轉(zhuǎn)移，這也是目前乳腺癌治療中的難題之一。然而關(guān)于發(fā)生復發(fā)和轉(zhuǎn)移的原因和機制卻仍舊很不明晰，同時這一現(xiàn)狀也提示我們對于乳腺癌的治療當有新的研究角度和方法的提出

2、。
　　在過去的25年中，由于過度夸大的腫瘤遺傳學-特別是癌基因和抑癌基因的作用，形成了以腫瘤細胞為中心的概念，腫瘤基質(zhì)細胞和腫瘤免疫細胞等被人逐漸忽視，因此不能全面的理解腫瘤細胞的生物學特征。經(jīng)過十多年的互相質(zhì)疑，腫瘤研究者逐漸形成了一種歷史性的重要的一致性看法，即腫瘤間質(zhì)細胞為主體及其構(gòu)建的腫瘤炎性微環(huán)境會激發(fā)并促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。同時腫瘤的炎癥微環(huán)境也積極促進腫瘤的進展。
　　骨髓間充質(zhì)干細胞是來源于骨髓的多能干細胞

3、，在機體發(fā)生創(chuàng)傷和炎癥時，該種細胞受趨化因子的驅(qū)動會趨化到機體炎性局部，積極參與機體的修復。腫瘤被稱為永不停息的炎癥，該類細胞近年被證實是腫瘤炎癥微環(huán)境中重要的間質(zhì)細胞之一，其可通過旁分泌途徑分泌趨化因子并與腫瘤表面的受體結(jié)合，同時激活下游癌基因通路，導致腫瘤惡性增殖，侵襲和轉(zhuǎn)移能力的增加，最終導致惡性腫瘤的復發(fā)和轉(zhuǎn)移。
　　在乳腺癌發(fā)生復發(fā)轉(zhuǎn)移時表現(xiàn)為病情的進展，而此時毒熱壅盛是其進展期常見證型之一，同時也是腫瘤內(nèi)部炎癥微環(huán)境的

4、外在表現(xiàn)，此時當以清熱解毒法來治療。復方苦參注射液是常用的具有清熱解毒功效的中藥注射液，我們采用其作為干預手段，以腫瘤炎癥微環(huán)境中的重要間質(zhì)細胞骨髓間充質(zhì)干細胞為研究對象，以調(diào)控其與乳腺癌細胞交互作用的趨化因子軸線及其下游基因的激活情況為目的，觀察苦參注射液對骨髓間充質(zhì)干細胞促乳腺癌惡性行為的干預作用。本課題研究主要包括如下內(nèi)容。
　　1不同來源的骨髓間充質(zhì)干細胞體外純化、鑒定及多能性比較
　　骨髓間充質(zhì)干細胞是來源于骨髓的

5、多能干細胞，可分化為多種組織細胞類型，包括成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞等?？山?jīng)體外誘導分化而進一步體內(nèi)移植生長，在組織工程中應用廣泛。我們通過文獻綜述，選擇了可獲得良好細胞活力的差速貼壁發(fā)來分別從SD大鼠和Ba1b/c小鼠的骨髓中獲取了不同鼠源的骨髓間充質(zhì)干細胞，通過生長曲線、誘導成骨和成脂分化、流式細胞術(shù)鑒別細胞表型來對細胞進行了鑒定和比較，最終認為SD大鼠的骨髓間充質(zhì)干細胞具有更好的細胞活性和多能性，選擇其為下一步實驗的細胞來源。<

6、br>　　2復方苦參注射液干預骨髓間充質(zhì)干細胞在腫瘤微環(huán)境中表型分化
　　干細胞的研究可能治愈臨床近80％的疾病，但就腫瘤和感染性疾病的治療仍就是其治療的盲區(qū)，同時其在組織工程應用中的安全性問題(突變?yōu)槟[瘤細胞)仍就是其研究領(lǐng)域的重要障礙之一，同時也為腫瘤干細胞理論提供了最直接的證據(jù)。因此研究成體干細胞與腫瘤的關(guān)系是目前國內(nèi)外研究中的重點之一。近期發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細胞在乳腺癌的發(fā)病、復發(fā)和轉(zhuǎn)移中起到了重要作用，但仍有爭議，研究前沿

7、認為腫瘤作為永不停息的炎癥，與機體損傷后修復等炎性反應等有很大類似，骨髓間充質(zhì)干細胞會受腫瘤炎性趨化因子梯度趨化到腫瘤間質(zhì)中，并在腫瘤炎性微環(huán)境中分化為具有腫瘤成纖維細胞表型的細胞，持續(xù)分泌SDF-1等趨化因子，并與腫瘤表面的CXCR4受體結(jié)合，通過旁分泌的途徑激活下游癌基因，從而促進腫瘤的發(fā)生，惡性增殖、血管新生，最終也會導致腫瘤的復發(fā)和轉(zhuǎn)移。我們通過腫瘤條件培養(yǎng)液來模擬腫瘤炎性微環(huán)境，觀察骨髓間充質(zhì)干細胞在腫瘤微環(huán)境中表型的變化，來

8、驗證以上病理變化的發(fā)生。
　　3復方苦參注射液對BMSCs與乳腺癌細胞間趨化因子軸線影響的體外實驗研究
　　選取對于炎癥反應具有較好抑制作用，在臨床廣泛應用的復方苦參注射液來作為干預手段，以BMSCs與乳腺癌4T1細胞交互作用的重要趨化因子軸線SDF-1/CXCR4為觀察靶點，在體外分別采用單獨干預和Transwell共培養(yǎng)體系來觀察在兩者交互作用時SDF-1/CXCR4動態(tài)變化。
　　4復方苦參注射液對BMSCs促乳

9、腺癌惡性行為影響的體外實驗研究
　　采用Transwell共培養(yǎng)體系觀察共培養(yǎng)情況下，BMSCs對乳腺癌4T1細胞系的增殖的影響，采用Transwell遷徙小室來觀察；條件培養(yǎng)液和共培養(yǎng)情況下，觀察BMSCs向4T1細胞遷移情況，采用Transwell侵襲小室來觀察，條件培養(yǎng)液和共培養(yǎng)情況下，觀察4T1乳腺癌細胞侵襲能力的變化。采用了mRNAarray的實驗方法，選取了與腫瘤惡性增殖、侵襲、粘附、凋亡、ECM相關(guān)等惡性行為高度相關(guān)

10、的90個基因為檢測目標，對苦參對體系的干預作用進行了初步的研究。
　　結(jié)論:
　　綜上本實驗得出以下結(jié)論：
　　1在本實驗室成功建立了骨髓間充質(zhì)干細胞分離，純化及鑒定的平臺，并比較了不同來源骨髓間充質(zhì)的特性，為實驗的開展提供良好的細胞來源。
　　2分別觀察了復方苦參注射液對正常骨髓間充質(zhì)細胞和乳腺癌4T1細胞在抑制率、誘導凋亡影響的差異性，最終發(fā)現(xiàn)在具有抑制腫瘤細胞和誘導凋亡的相同濃度下，復方苦參注射液對正常的骨

11、髓間充質(zhì)干細胞并未表現(xiàn)出明顯影響，提示具有此特性的復方苦參注射液是理想的長期干預藥物。同時和化療藥DDP的對比也提示我們，復方苦參注射液在低濃度的干預條件下可能并不是完全通過對腫瘤的直接抑制而起到抗復發(fā)轉(zhuǎn)移的作用。
　　3在腫瘤微環(huán)境情況下，骨髓間充質(zhì)干細胞的表型發(fā)生了變化，免疫熒光結(jié)果顯示其特異性蛋白表達量和強度隨著干預時間增加而不斷增強。采用復方苦參注射液干預后發(fā)現(xiàn)，可抑制骨髓間充質(zhì)干細胞向腫瘤相關(guān)成纖維細胞表型的變化。

12、>　　4不同濃度苦參注射液干預后，在常氧和低氧條件下其均可降低乳腺癌4T1細胞表面CXCR4受體的表達，同時在低氧環(huán)境下骨髓間充質(zhì)干細胞促乳腺癌4T1細胞增殖能力強于常氧環(huán)境，低氧環(huán)境下骨髓問充質(zhì)干細胞向乳腺癌4T1細胞的遷移能力較常氧環(huán)境增加?？鄥σ陨檄h(huán)節(jié)均有一定的抑制作用。同時發(fā)現(xiàn)在低氧共培養(yǎng)48h條件下，復方苦參注射液可明顯降低細胞共培養(yǎng)上清中的SDF-1的濃度，并影響兩者細胞之間的互相遷移。(P>0.05)
　　5共培養(yǎng)

13、后乳腺癌惡性行為增加，表現(xiàn)在低氧環(huán)境下在BMSCs條件培養(yǎng)液中的增殖能力增強，共培養(yǎng)低氧環(huán)境下侵襲能力增強。采用mRNAarray基因檢測后，發(fā)現(xiàn)在共培養(yǎng)的條件下相關(guān)惡性行為的基因上調(diào)，在基因?qū)用鏋槲覀兘忉屃诉@一行為的可能原因之一。在用復方苦參注射液干預后發(fā)現(xiàn)由MDSCs造成的乳腺癌增加的惡性行為表現(xiàn)受到一定程度的抑制，同時在基因?qū)用嬉脖憩F(xiàn)為相關(guān)基因型受抑制，主要表現(xiàn)在侵襲等惡性行為相關(guān)的基因明顯受抑，雖然也出現(xiàn)了部分癌基因的上調(diào)，但最