六價鉻對大鼠肝細胞線粒體呼吸鏈電子漏的影響研究.pdf

1、目的：
　　 確定適用于線粒體功能活性試驗研究的線粒體提取方法,并初步探索Cr(Ⅵ)誘導(dǎo)大鼠肝細胞線粒體呼吸鏈電子漏增加的機制,為闡明Cr(Ⅵ)誘導(dǎo)肝細胞氧化損傷的機制提供線索。
　　 方法：
　　 分別用蔗糖法和試劑盒法提取大鼠肝細胞線粒體,用OPTEC光學顯微鏡和H-600透射電子顯微鏡觀察線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)。用960MC熒光分光光度計和Clark氧電極測定線粒體提取0.5h、1.5h和2.5h后的線粒

2、體膜電位,ST3,ST4及呼吸控制率。用SP-756P可見分光光度計測定線粒體及其他亞細胞器特異性標志酶的酶比活性。分別以谷氨酸/蘋果酸和琥珀酸為呼吸底物,啟動線粒體主呼吸鏈和次呼吸鏈的電子傳遞。測定不同濃度的Cr(Ⅵ)對肝細胞線粒體呼吸鏈ROS生成量的影響。用Clark氧電極測定肝細胞線粒體主呼吸鏈和次呼吸鏈的基礎(chǔ)呼吸速率。線粒體懸液用Cr(Ⅵ),GSH和各種復(fù)合體抑制劑處理。其中,線粒體主呼吸鏈電子傳遞用Rot,DPI和Ant單獨或

3、聯(lián)合處理,而線粒體次呼吸鏈電子傳遞用Rot,DPI,TTFA和Ant單獨或聯(lián)合處理。用VarioskanFlash4.00.52多功能酶標儀分別測定各組線粒體主呼吸鏈和次呼吸鏈O2·-和ROS的生成量。
　　 結(jié)果：
　　 1.蔗糖法提取的線粒體膜電位和呼吸控制率顯著高于試劑盒法,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。兩種方法提取的線粒體標志酶的純化倍數(shù)沒有統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。兩種方法提取的線粒體超微結(jié)構(gòu)均完整,未見

4、腫脹或損傷,但試劑盒法提取的線粒體純度較差,可見大量泡狀體。
　　 2.Cr(Ⅵ)在0-100μM的濃度范圍內(nèi),能誘導(dǎo)肝細胞線粒體主呼吸鏈和次呼吸鏈ROS的生成量隨著Cr(Ⅵ)濃度的增加而增加,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。線粒體次呼吸鏈的基礎(chǔ)呼吸速率大于主呼吸鏈的基礎(chǔ)呼吸速率,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 3.以谷氨酸/蘋果酸為呼吸底物時,與對照組相比,Rot組,Rot+Ant組和DPI+Ant組的RO

5、S含量和電子漏增加,Rot+DPI組和Ant組ROS含量增加,DPI組的ROS含量降低(P＜0.05)。與Cr(Ⅵ)組相比,Cr(Ⅵ)+Rot組,Cr(Ⅵ)+Am組,Cr(Ⅵ)+Rot+DPI組,Cr(Ⅵ)+Rot+Ant組和Cr(Ⅵ)+DPI+Ant組的ROS含量和電子漏增加,Cr(Ⅵ)+DPI組ROS含量增加(P＜0.05)。
　　 4.以琥珀酸為呼吸底物時,與對照組相比,Rot組,DPI組,Rot+DPI組,Rot+TTF

6、A組和DPI+TTFA組ROS含量和電子漏降低,TTFA組,Ant組,Rot+Ant組,Rot+DPI組和TTFA+Ant組的RQS含量和電子漏增加,Rot+TTFA組的ROS含量降低(P＜0.05)。與Cr(Ⅵ)組相比,Cr(Ⅵ)+Rot組,Cr(Ⅵ)+DPI組和Cr(Ⅵ)+Rot+DPI組的ROS含量沒有統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。Cr(Ⅵ)+TTFA組和Cr(Ⅵ)+Rot+TTFA組,Cr(Ⅵ)+Ant組,Cr(Ⅵ)+Rot+An

7、t組,Cr(Ⅵ)+DPI+Ant組和Cr(Ⅵ)+TTFA+Ant組ROS生成量和電子漏增加,Cr(Ⅵ)+DPI+TTFA組減少(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.蔗糖法提取的線粒體,與試劑盒法相比,線粒體膜功能和呼吸功能良好,純度高,超微結(jié)構(gòu)完整,能滿足后續(xù)線粒體功能活性研究的需要。
　　 2.50uM Cr(Ⅵ)誘導(dǎo)肝細胞線粒體主呼吸鏈電子漏增加,主要從復(fù)合體Ⅰ和復(fù)合體Ⅲ的泛醌結(jié)合位點漏出。對于次呼吸鏈