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文檔簡介
1、目的:鈉通道SCN1A基因與癲癇密切相關(guān),其表達(dá)水平異常導(dǎo)致癲癇,尤其是Dravet綜合征。mRNA3′非翻譯區(qū)(3′ untranslated region,3′UTR)在基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控中發(fā)揮重要作用,3′UTR功能異??捎绊懟虻谋磉_(dá),導(dǎo)致疾病發(fā)生。本研究通過對SCN1A基因3′UTR功能分析來鑒定其轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件,并對癲癇患者SCN1A基因3′UTR進(jìn)行變異位點(diǎn)篩查,分析3′UTR突變與癲癇的相關(guān)性。該研究將有助于認(rèn)識S
2、CN1A基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)理及癲癇發(fā)病機(jī)制,具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。
方法:⑴對來自同一基因簇的中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)的鈉通道SCN1A、SCN2A和SCN3A基因,采用Vector NTI軟件對其3′UTR進(jìn)行保守性分析。⑵雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測保守序列對報(bào)告基因表達(dá)的影響。⑶生物素標(biāo)記保守序列作為RNA探針,與HEK-293細(xì)胞質(zhì)蛋白進(jìn)行RNA電泳遷移阻滯實(shí)驗(yàn)(RNA Electrophoretic Mobility
3、Shift Assay, RNA-EMSA)。⑷Biotin-Pull down及SDS-PAGE電泳分離與RNA探針結(jié)合的HEK-293細(xì)胞質(zhì)蛋白,液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)分析RNA結(jié)合蛋白。加入蛋白抗體進(jìn)行SuperShift實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步鑒定RNA結(jié)合蛋白。⑸shRNA體外干擾實(shí)驗(yàn)證實(shí)RNA結(jié)合蛋白的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用。⑹對SCN1A基因外顯子區(qū)及啟動子區(qū)未發(fā)現(xiàn)異常的Dravet綜合征患者, PCR擴(kuò)增其鈉通道SCN1A基因3
4、′UTR,PCR產(chǎn)物直接測序,鑒定鈉通道SCN1A基因3′UTR變異位點(diǎn)。對變異位點(diǎn)進(jìn)行保守性分析及RNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測(RNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件RNAfold: http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi)。⑺雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測突變位點(diǎn)對報(bào)告基因表達(dá)的影響。⑻熒光定量PCR檢測突變位點(diǎn)對報(bào)告基因mRNA穩(wěn)定性的影響。⑼RNA-EMSA分析突變位點(diǎn)對UTR序列與細(xì)胞質(zhì)蛋白結(jié)合的影響
5、。⑽Biotin-Pull down及SDS-PAGE電泳分離與RNA探針結(jié)合的HEK-293細(xì)胞質(zhì)蛋白,LC-MS/MS分析RNA結(jié)合蛋白。結(jié)合蛋白EMSA進(jìn)一步證實(shí)。
結(jié)果:①保守性分析發(fā)現(xiàn)SCN1A、SCN2A和SCN3A基因3′UTR存在9個(gè)共同保守區(qū),分別命名為CS1至CS9。②雙熒光素酶活性檢測結(jié)果顯示,9個(gè)保守區(qū)分別敲除后,與敲除前比, SCN1A基因3′UTR的雙熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)質(zhì)粒在HEK-293細(xì)胞中的
6、相對熒光素酶活性均上升(P<0.01),9個(gè)保守區(qū)均負(fù)性調(diào)控報(bào)告基因的表達(dá)。③保守序列探針與HEK293細(xì)胞質(zhì)蛋白進(jìn)行RNA-EMSA實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)CS2、CS5、CS6和CS9存在細(xì)胞質(zhì)蛋白特異性結(jié)合,CS2、CS5、CS6和CS9是結(jié)合蛋白的調(diào)控元件。④Biotin-Pull down及SDS-PAGE分別分離CS2、CS5、CS6和CS9的結(jié)合蛋白各得到一條蛋白條帶。LC-MS/MS分析蛋白條帶可能是甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyce
7、raldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)及蘋果酸脫氫酶(Malate Dehydrogenase2, MDH2)。與相應(yīng)的蛋白抗體進(jìn)SuperShift實(shí)驗(yàn),結(jié)果證實(shí),CS2的結(jié)合蛋白為GAPDH,CS5、CS6和CS9的結(jié)合蛋白是MDH2。⑤GAPDH、MDH2 shRNA沉默表達(dá)質(zhì)粒干擾HEK-293細(xì)胞內(nèi)源性的GAPDH、MDH2表達(dá)后,與對照shRNA比, SCN1A基因3′UTR的
8、雙熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)質(zhì)粒相對熒光素酶活性上升(P<0.01)。GAPDH、MDH2表達(dá)下調(diào)可導(dǎo)致報(bào)告基因表達(dá)增強(qiáng)。⑥在24例Dravet綜合征患者中發(fā)現(xiàn)1例患者鈉通道SCN1A基因3′UTR雜合突變(c.*1794C>T),突變來自其母親。突變位點(diǎn)物種間保守性分析結(jié)果顯示高度保守,RNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn),該突變位點(diǎn)顯著改變RNA二級結(jié)構(gòu)。⑦雙熒光素酶檢測結(jié)果,與野生型1794C的SCN1A基因3′UTR的雙熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)質(zhì)粒比,
9、突變型1794T的SCN1A基因3′UTR的雙熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)質(zhì)粒在HEK-293細(xì)胞系中的相對熒光素酶活性下降低約15%(P<0.01),突變位點(diǎn)負(fù)性調(diào)控報(bào)告基因表達(dá)。mRNA穩(wěn)定性檢測發(fā)現(xiàn),在HEK-293細(xì)胞系中,與野生型質(zhì)粒相比,突變型質(zhì)粒報(bào)告基因 mRNA半衰期縮短,突變導(dǎo)致報(bào)告基因mRNA穩(wěn)定性降低。RNA-EMSA實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),帶有1794U的突變型RNA探針可見特異性阻滯條帶,而1794C的野生型RNA探針未見阻滯條帶,
10、突變提高SCN1A基因3′UTR與HEK-293細(xì)胞質(zhì)蛋白結(jié)合能力。⑧Biotin-Pull down及SDS-PAGE分別分離結(jié)合蛋白得到一條蛋白條帶。LC-MS/MS分析蛋白條帶可能是甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)。采用純化的GAPDH蛋白做RNA-EMSA實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)突變型探針存在特異性阻滯條帶,證實(shí)此結(jié)合蛋白為GAPDH。
結(jié)論:⑴RNA結(jié)合蛋白GAPDH及MDH2通過與SCN1A基因3′UTR調(diào)控元件結(jié)合,下調(diào)報(bào)告
11、基因表達(dá)。提示GAPDH及MDH2可能與SCN1A基因3′UTR調(diào)控元件結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)性調(diào)控SCN1A基因表達(dá)。⑵SCN1A、SCN2A和SCN3A基因3′UTR存在共同保守區(qū),提示SCN1A、SCN2A和SCN3A基因有共同的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制。⑶GAPDH通過與含突變(c.*1794C>T)的SCN1A基因3′UTR結(jié)合,影響報(bào)告基因 mRNA的穩(wěn)定性,從而下調(diào)報(bào)告基因的表達(dá)。提示該突變位點(diǎn)很可能在轉(zhuǎn)錄后水平上異常調(diào)控SCN1A基
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