鈉通道SCN1A基因3′非翻譯區(qū)的功能鑒定及其與Dravet綜合征的相關(guān)性研究.pdf

1、目的：鈉通道SCN1A基因與癲癇密切相關(guān)，其表達水平異常導(dǎo)致癲癇，尤其是Dravet綜合征。mRNA3′非翻譯區(qū)(3′ untranslated region,3′UTR)在基因表達的轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控中發(fā)揮重要作用，3′UTR功能異?？捎绊懟虻谋磉_，導(dǎo)致疾病發(fā)生。本研究通過對SCN1A基因3′UTR功能分析來鑒定其轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件，并對癲癇患者SCN1A基因3′UTR進行變異位點篩查，分析3′UTR突變與癲癇的相關(guān)性。該研究將有助于認識S

2、CN1A基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機理及癲癇發(fā)病機制，具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。
　　方法：⑴對來自同一基因簇的中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達的鈉通道SCN1A、SCN2A和SCN3A基因，采用Vector NTI軟件對其3′UTR進行保守性分析。⑵雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測保守序列對報告基因表達的影響。⑶生物素標(biāo)記保守序列作為RNA探針，與HEK-293細胞質(zhì)蛋白進行RNA電泳遷移阻滯實驗(RNA Electrophoretic Mobility

3、Shift Assay, RNA-EMSA)。⑷Biotin-Pull down及SDS-PAGE電泳分離與RNA探針結(jié)合的HEK-293細胞質(zhì)蛋白，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)分析RNA結(jié)合蛋白。加入蛋白抗體進行SuperShift實驗進一步鑒定RNA結(jié)合蛋白。⑸shRNA體外干擾實驗證實RNA結(jié)合蛋白的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用。⑹對SCN1A基因外顯子區(qū)及啟動子區(qū)未發(fā)現(xiàn)異常的Dravet綜合征患者， PCR擴增其鈉通道SCN1A基因3

4、′UTR，PCR產(chǎn)物直接測序，鑒定鈉通道SCN1A基因3′UTR變異位點。對變異位點進行保守性分析及RNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測(RNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件RNAfold: http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi)。⑺雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測突變位點對報告基因表達的影響。⑻熒光定量PCR檢測突變位點對報告基因mRNA穩(wěn)定性的影響。⑼RNA-EMSA分析突變位點對UTR序列與細胞質(zhì)蛋白結(jié)合的影響

5、。⑽Biotin-Pull down及SDS-PAGE電泳分離與RNA探針結(jié)合的HEK-293細胞質(zhì)蛋白，LC-MS/MS分析RNA結(jié)合蛋白。結(jié)合蛋白EMSA進一步證實。
　　結(jié)果：①保守性分析發(fā)現(xiàn)SCN1A、SCN2A和SCN3A基因3′UTR存在9個共同保守區(qū)，分別命名為CS1至CS9。②雙熒光素酶活性檢測結(jié)果顯示，9個保守區(qū)分別敲除后，與敲除前比， SCN1A基因3′UTR的雙熒光素酶報告基因表達質(zhì)粒在HEK-293細胞中的

6、相對熒光素酶活性均上升（P<0.01)，9個保守區(qū)均負性調(diào)控報告基因的表達。③保守序列探針與HEK293細胞質(zhì)蛋白進行RNA-EMSA實驗，發(fā)現(xiàn)CS2、CS5、CS6和CS9存在細胞質(zhì)蛋白特異性結(jié)合，CS2、CS5、CS6和CS9是結(jié)合蛋白的調(diào)控元件。④Biotin-Pull down及SDS-PAGE分別分離CS2、CS5、CS6和CS9的結(jié)合蛋白各得到一條蛋白條帶。LC-MS/MS分析蛋白條帶可能是甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyce

7、raldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)及蘋果酸脫氫酶(Malate Dehydrogenase2, MDH2)。與相應(yīng)的蛋白抗體進SuperShift實驗，結(jié)果證實，CS2的結(jié)合蛋白為GAPDH，CS5、CS6和CS9的結(jié)合蛋白是MDH2。⑤GAPDH、MDH2 shRNA沉默表達質(zhì)粒干擾HEK-293細胞內(nèi)源性的GAPDH、MDH2表達后，與對照shRNA比， SCN1A基因3′UTR的

8、雙熒光素酶報告基因表達質(zhì)粒相對熒光素酶活性上升(P<0.01)。GAPDH、MDH2表達下調(diào)可導(dǎo)致報告基因表達增強。⑥在24例Dravet綜合征患者中發(fā)現(xiàn)1例患者鈉通道SCN1A基因3′UTR雜合突變(c.*1794C>T)，突變來自其母親。突變位點物種間保守性分析結(jié)果顯示高度保守，RNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，該突變位點顯著改變RNA二級結(jié)構(gòu)。⑦雙熒光素酶檢測結(jié)果，與野生型1794C的SCN1A基因3′UTR的雙熒光素酶報告基因表達質(zhì)粒比，

9、突變型1794T的SCN1A基因3′UTR的雙熒光素酶報告基因表達質(zhì)粒在HEK-293細胞系中的相對熒光素酶活性下降低約15％(P<0.01)，突變位點負性調(diào)控報告基因表達。mRNA穩(wěn)定性檢測發(fā)現(xiàn)，在HEK-293細胞系中，與野生型質(zhì)粒相比，突變型質(zhì)粒報告基因 mRNA半衰期縮短，突變導(dǎo)致報告基因mRNA穩(wěn)定性降低。RNA-EMSA實驗發(fā)現(xiàn)，帶有1794U的突變型RNA探針可見特異性阻滯條帶，而1794C的野生型RNA探針未見阻滯條帶，

10、突變提高SCN1A基因3′UTR與HEK-293細胞質(zhì)蛋白結(jié)合能力。⑧Biotin-Pull down及SDS-PAGE分別分離結(jié)合蛋白得到一條蛋白條帶。LC-MS/MS分析蛋白條帶可能是甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)。采用純化的GAPDH蛋白做RNA-EMSA實驗發(fā)現(xiàn)突變型探針存在特異性阻滯條帶，證實此結(jié)合蛋白為GAPDH。
　　結(jié)論：⑴RNA結(jié)合蛋白GAPDH及MDH2通過與SCN1A基因3′UTR調(diào)控元件結(jié)合，下調(diào)報告

11、基因表達。提示GAPDH及MDH2可能與SCN1A基因3′UTR調(diào)控元件結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平負性調(diào)控SCN1A基因表達。⑵SCN1A、SCN2A和SCN3A基因3′UTR存在共同保守區(qū)，提示SCN1A、SCN2A和SCN3A基因有共同的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制。⑶GAPDH通過與含突變（c.*1794C>T）的SCN1A基因3′UTR結(jié)合，影響報告基因 mRNA的穩(wěn)定性，從而下調(diào)報告基因的表達。提示該突變位點很可能在轉(zhuǎn)錄后水平上異常調(diào)控SCN1A基