灰樹花多糖對四氯化碳肝損傷的保護作用及其機制的研究.pdf

1、化學性肝損傷已成為繼病毒性肝損傷之后的第二大肝病誘因，目前臨床應(yīng)用的500～1000余種中西藥物以及多種化學藥品，均可引起不同程度的肝病。據(jù)國內(nèi)外資料報道，有20％的暴發(fā)性肝衰竭由化學藥物引起。近年來，化學性肝損傷呈增加趨勢，嚴重威脅人們的生命健康。但目前臨床上仍缺乏有效的防治藥物，因而加強肝臟損傷保護研究、開展對化學性肝病的防護工作，對于提高人類健康水平具有重要意義。
　　 四氯化碳(carbon tetrachloride，

2、CCl4)肝損傷是經(jīng)典的肝損傷模型，CC14對肝臟具有較強的損傷作用，可導致肝細胞的脂肪變性、壞死、纖維化，因此，被廣泛用來制作體內(nèi)、外肝損傷實驗模型。
　　 灰樹花多糖(Polysaccharide of Grifola Frondosa，PGF)是從一種大型真菌灰樹花(Grifola frondosa)子實體或菌絲內(nèi)提取的一種真菌多糖，其活性基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)為具有高度分支的β-1，3-葡聚糖和β-1，6-葡聚糖。藥理分析表明灰樹花多

3、糖具有明顯的抗腫瘤、改善免疫系統(tǒng)功能、調(diào)節(jié)血糖、血脂及膽固醇水平、清除氧自由基等作用。但有關(guān)灰樹花多糖對肝損傷的保護及其機制研究尚未見相關(guān)報道。
　　 通過體外、體內(nèi)實驗，探討PGF對四氯化碳(CC14)誘導的肝臟細胞（組織）損傷保護作用及其機制，為PGF在肝損傷性疾病的防治提供實驗依據(jù)。
　　 (1)培養(yǎng)L-02細胞，以60％飽和CC14損傷液建立穩(wěn)定的CC14肝細胞損傷模型；
　　 (2)細胞分為六組：正常對

4、照組、CC14損傷組、不同濃度的PGF保護組(50μg/ml，lOOμg/ml，200μg/ml，400μg/m1)，PGF于損傷前12小時加入。
　　 (3)Giemsa染色法對細胞進行形態(tài)學的觀察。
　　 (4) MTT法檢測細胞活性的影響；
　　 (5)分光光度法檢測細胞培養(yǎng)液上清液中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)的活性；
　　 (6)分光光度法檢測細胞內(nèi)丙二醛(MDA)

5、含量和總超氧化物岐化酶(SOD)活力的變化；
　　 (7)激光共聚焦顯微鏡觀察細胞內(nèi)游離Ca2+濃度變化；
　　 (8)流式細胞術(shù)檢測細胞線粒體膜電位（Rh123對細胞進行染色）
　　 (9)Western blot法檢測各組細胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白bcl-2、bax表達量
　　 (1)建立小鼠急性肝損傷模型；
　　 (2)將小鼠分為8組：空白對照組，CC14損傷組，6組不同濃度PGF保護組(4.5mg

6、/kg,9mg/kg,18mg/kg,36mg/kg,72mg/kg,144mg/kg);
　　 (3)肝組織石蠟切片、HE染色法，觀察肝臟組織的組織病理學變化；
　　 (4)血清轉(zhuǎn)氨酶活性檢測丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)的活性變化；
　　 (5)肝組織勻漿生化檢測肝細胞勻漿液中丙二醛( MDA)含量和總超氧化物岐化酶(SOD)活力的變化；
　　 (6)Western blo

7、t法檢測肝組織勻漿中bcl-2、bax含量的變化。
　　 (1)形態(tài)學觀察正常組L-02細胞呈不規(guī)則多角形，立體感強，形態(tài)飽滿；細胞核圓形，位于細胞中央，約占細胞體積的二分之一，細胞長滿瓶壁后呈鋪路石狀。損傷組細胞，立體感沒有正常組強，而且有較多的細胞發(fā)生凋亡；而各PGF保護組細胞，存活狀態(tài)均優(yōu)于損傷組細胞，以lOOμg/ml保護組效果最佳。
　　 (2)MTT法分析：與CC14損傷組（細胞相對存活率32.31％）相比，

8、PGF保護組可維持較高的細胞相對存活率，在50～100μg/ml范圍內(nèi)，對CC14損傷的保護效果隨PGF作用濃度的增高而增強，最佳保護濃度為100μg/ml，細胞相對存活率達74.92％：
　　 以下指標中保護組均為最佳濃度（100μg/ml）保護的結(jié)果。
　　 (3)培養(yǎng)液上清轉(zhuǎn)氨酶活性檢測：
　　 ①AST活性：正常組70.11(IU/L)，損傷組152.16(IU/L)，保護組78.47(IU/L)；

9、>　　 ②ALT活性：正常組35.26(IU/L)，損傷組96.47(IU/L)，保護組44.39(IU/L)。
　　 (4)細胞SOD、MDA檢測：
　　 ①SOD活力：正常組121.94U/mgprot，損傷組56.55 U/mgprot，保護組112.67 U/mgprot;
　　 ②MDA含量：正常組2.14nmol/mgprot，損傷組5.19 nmol/mgprot，保護組2.55 nmol/mgp

10、rot（與正常對照組1P＞0.05）；
　　 (5)細胞內(nèi)游離Ca+的相對濃度：正常組為302.6、損傷組2393.4、保護組529.4。
　　 (6)線粒體膜電位(△ψm)測量：正常組為455.17、損傷組為96.26和保護組為248.75;
　　 (7)Western-blot檢測結(jié)果：將Western-blot檢測結(jié)果圖采用NIH系統(tǒng)Image J圖像分析軟件分析蛋白相對表達量，結(jié)果顯示：
　　 ①

11、Bcl-2的相對表達量：正常組為1.53，損傷組為0.16，保護組1.20。
　　 ②Bax的相對表達量：正常組為0.4，損傷組為1.01，保護組為0.71。
　　 2、體內(nèi)實驗結(jié)果
　　 (1)肝臟形態(tài)學觀察：正常對照組小鼠肝臟顏色鮮紅，質(zhì)地柔軟；純損傷組小鼠肝臟體積增大，呈土黃色，質(zhì)地變硬，或可見針尖樣大小結(jié)節(jié)；各PGF保護組小鼠肝臟形態(tài)介于正常對照組與純損傷組之間，保護效果明顯
　　 (2)病理學觀

12、察：正常對照組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝索排列規(guī)則，細胞形態(tài)正常，無炎細胞浸潤。CC14損傷組肝竇內(nèi)大量炎細胞浸潤，肝索排列紊亂，中央靜脈周圍大片肝細胞細胞腫脹。各PGF保護組肝細胞壞死和炎細胞浸潤明顯減輕，肝小葉結(jié)構(gòu)、細胞形態(tài)基本正常；
　　 以下指標中保護組均為最佳濃度(72mg/kg)保護的結(jié)果。
　　 (3)血清酶學檢測：
　　 ①AST活性：正常組30.52(IU/L)，損傷組142.87(IU/L)，保護組4

13、3.69(IU/L)（與正常對照組P>0.05）；
　　 ②ALT活性：正常組15.18(IU/L)，損傷組218.37(IU/L)，保護組57.42(IU/L);
　　 (4)肝勻漿組織化學檢測：
　　 ①SOD含量：正常組93.44U/mgprot，損傷組47.28 U/mgprot，保護組88.47U/mgprot；
　　 ②MDA含量：正常組3.62nmol/mgprot，CCl4損傷組7.83

14、nmol/mgprot，保護組4.51 nmol/mgprot;
　　 (5)Western-blot檢測結(jié)果：將Western-blot檢測結(jié)果圖采用NIH系統(tǒng)Image J圖像分析軟件分析蛋白相對表達量，結(jié)果顯示：
　　 ①Bcl-2的相對表達量：正常組為1.05，損傷組為0.21，保護組為0.95;
　　 ②Bax的相對表達量：正常組為0.27，損傷組為0.87，保護組為0.51;
　　 1、建立了

15、飽和CC14損傷液體外損傷肝細胞實驗模型；
　　 2、確定了PGF對CCl4誘導的體外肝細胞損傷具有顯著保護作用，最佳保護濃度為100μg/ml;
　　 3、PGF可通過抑制肝細胞內(nèi)Ca2+濃度的升高及改變凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax的表達水平，影響線粒體相關(guān)的凋亡信號傳遞過程，有效地防止線粒體膜電位的下降和一系列下游事件的發(fā)生，減少細胞凋亡；
　　 4、確定了PGF對CCl4誘導的體內(nèi)肝細胞損傷的最佳保護濃度