一氧化氮合酶抑制物對大鼠離體左心室乳頭肌收縮力的影響及其機(jī)制.pdf

1、研究背景和目的：
　　一氧化氮（Nitric oxide，NO）為廣泛存在于生物體組織細(xì)胞中的一種信號分子；由其前體L-精氨酸（L-arginine，L-Arg）在一氧化氮合酶（Nitric oxide synthase，NOS）催化下轉(zhuǎn)化而來。體內(nèi)有3種NOS亞型；即神經(jīng)元型NOS（Neuronal NOS，nNOS）、誘導(dǎo)型NOS（Inducible NOS，iNOS）及內(nèi)皮型NOS（Endothelial NOS，eNOS)

2、。nNOS和eNOS又統(tǒng)稱為構(gòu)成型，為Ca2+-依賴性的NOS，催化合成少量的NO，主要參與生理功能調(diào)節(jié)；iNOS為Ca2+-非依賴性的，生理狀態(tài)下很少表達(dá)；但可被細(xì)胞因子和細(xì)菌脂多糖等許多病理因子誘導(dǎo)表達(dá)，催化合成大量的NO，參與病理狀態(tài)的調(diào)節(jié)。已知NO在心血管、免疫和神經(jīng)等系統(tǒng)具有廣泛的生理、病理作用，尤其是血管內(nèi)皮細(xì)胞合成、釋放的NO除了介導(dǎo)內(nèi)皮依賴性血管舒張，還具有抗氧化、抗血小板聚集、抑制白細(xì)胞黏附、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖等作

3、用，因此，NO是心血管功能調(diào)節(jié)重要因子。
　　體內(nèi)存在一種調(diào)節(jié)NO生成的內(nèi)源性機(jī)制，在組織細(xì)胞新陳代謝過程中產(chǎn)生的L-Arg同系物非對稱性二甲基精氨酸（Asymmetric dimethylarginine，ADMA)為NOS內(nèi)源性抑制物；化學(xué)合成的L-Arg同系物 NG-硝基-L-精氨酸（NG-nitro-L-arginine，L-NNA）和NG-硝基-L-精氨酸甲酯（NG-Nitro-L-arginine Methyl Est

4、er，L-NAME）為NOS外源性抑制物；它們均可與L-Arg競爭NOS，一方面減少NO生成，另一方面使L-Arg與NOS之間的電子傳遞脫偶聯(lián)，使反應(yīng)中的分子氧（O2）成為唯一的受電子體，從而生成超氧陰離子增多，導(dǎo)致氧化應(yīng)激增加。我室和國內(nèi)外學(xué)者大量研究表明，內(nèi)源性ADMA升高與動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、糖尿病、和慢性充血性心力衰竭密切相關(guān)；慢性充血性心力衰竭病人血漿ADMA濃度升高與其心臟左室射血分?jǐn)?shù)和左室心功能呈負(fù)相關(guān)；給成年健康男性志

5、愿者靜脈注射ADMA明顯升高血壓，外周阻力增加，心率降低，心輸出量減少。最近我室又研究發(fā)現(xiàn)，鏈脲佐菌素誘導(dǎo)致糖尿病大鼠血中內(nèi)源性ADMA升高，伴隨明顯的心率減慢、心臟舒張和收縮功能障礙，左心室射血分?jǐn)?shù)降低。這些研究雖提示，血漿ADMA升高可能與心率減慢、心肌收縮力減弱、心輸出量減少有關(guān)；但卻不能區(qū)分上述病理狀態(tài)下血漿內(nèi)源性ADMA升高對心臟的抑制作用究竟是通過對心肌收縮力的直接抑制，還是通過收縮血管、升高血壓所引起的間接作用所致。

6、>　　因此，本研究擬先在體外實(shí)驗(yàn)，通過制備離體大鼠左心室乳頭肌條，觀察內(nèi)、外性NOS抑制物對電刺激大鼠離體乳頭肌收縮的直接作用；然后再在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，通過給正常SD大鼠腹腔注射外源性NOS抑制物L(fēng)-NNA10周，觀察長時(shí)間體內(nèi)高L-NNA模型大鼠的離體乳頭肌對電刺激收縮反應(yīng)的變化；最后在培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞株H9C2細(xì)胞，觀察ADMA孵育后對心肌細(xì)胞中基礎(chǔ) Ca2+濃度和刺激反應(yīng) Ca2+濃度變化的影響以及調(diào)節(jié)肌漿網(wǎng)內(nèi)鈣釋放的雷諾丁受體2（R

7、yanodine receptor-2，RyR2）基因表達(dá)的改變。為闡明NOS抑制物對心血管功能的調(diào)節(jié)作用以及在糖尿病和心血管疾病狀態(tài)下內(nèi)源性ADMA升高的病理作用及其機(jī)制提供新的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
　　方法：
　　1）離體實(shí)驗(yàn)：通過制備大鼠離體左心室乳頭肌條，用Muscle Research System記錄電刺激（頻率1 Hz、波寬5 ms）誘導(dǎo)乳頭肌收縮的發(fā)展張力峰值；此外，還檢測乳頭肌中脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)物丙二醛（Malondi

8、aldehyde，MDA）含量和NO代謝產(chǎn)物含量；
　　2）在體實(shí)驗(yàn)：通過給SD大鼠腹腔注射L-NNA（30 mg/Kg）10周，檢測其離體左心室乳頭肌對電刺激收縮的發(fā)展張力；并用RT-PCR檢測心肌RyR2的mRNA水平；
　　3）細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：用ADMA孵育培養(yǎng)的H9C2心肌細(xì)胞，采用激光共聚焦顯微鏡檢測心肌細(xì)胞中基礎(chǔ)游離 Ca2+濃度以及給予CaCl2刺激后心肌細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)性Ca2+濃度的變化。
　　結(jié)果：
　　

9、1）離體實(shí)驗(yàn)：
　　①從正常SD大鼠左心室分離的乳頭肌，加靜息張力平衡50 min后，第一次電刺激乳頭肌產(chǎn)生明顯的等長收縮，其發(fā)展張力峰值為1.64±0.76 mN；再平衡75 min后，第二次用同樣強(qiáng)度的電刺激，仍可使乳頭肌產(chǎn)生相似的等長收縮，其發(fā)展張力峰值為1.68±0.68 mN；統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，正常大鼠乳頭肌兩次收縮發(fā)展張力峰值無明顯區(qū)別（P>0.05，n=5）；表明從正常SD大鼠左心室分離的乳頭肌在間隔75 min平衡前

10、后對頻率為1Hz、波寬5 ms強(qiáng)度的電刺激可產(chǎn)生穩(wěn)定的、可重復(fù)性的收縮。
　　②用30mmol/L內(nèi)源性NOS抑制物ADMA孵育大鼠離體乳頭肌60 min后，明顯抑制乳頭肌對電刺激收縮反應(yīng)張力峰值（P<0.05，n=5）；與此相似，用30mmol/L外源性NOS抑制物L(fēng)-NNA或 L-NAME孵育60 min亦可明顯抑制乳頭肌對電刺激的收縮反應(yīng)（P<0.01，n=5）。
　?、塾? mmol/L的NO合成前體L-精氨酸（L-

11、arginine，L-Arg）或10mmol/L的NO供體硝普鈉（Sodium nitroprusside，SNP）預(yù)孵育乳頭肌15 min，再與30 mmol/L的ADMA共孵育肌條60 min，均可逆轉(zhuǎn)ADMA對電刺激乳頭肌收縮的抑制作用(P<0.01，n=5）；L-Arg處理還能改善ADMA引起的乳頭肌MDA含量的升高（P<0.05，n=5），而SNP有增加ADMA引起乳頭肌NO含量降低的趨勢，但無顯著性差異。
　?、軣o論是

12、用1mmol/L的蛋白激酶C（Protein kinase C，PKC）抑制劑Chelerythrine（Che），還是用10 mmol/L的抗氧化劑N-乙酰-L-半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine，NAC）預(yù)孵育乳頭肌15 min，再與30 mmol/L的ADMA共孵育肌條60 min，均可改善ADMA對電刺激乳頭肌收縮的抑制作用（P<0.01，n=5）；同時(shí)降低乳頭肌MDA含量（P<0.05，n=5）。
　?、萦?/p>

13、0.1 mmol/L鈣離子載體A23187預(yù)孵育乳頭肌15 min，再與30mmol/L的ADMA共孵育肌條60 min，可逆轉(zhuǎn)ADMA對電刺激乳頭肌收縮的抑制作用(P<0.01，n=5），A23187單獨(dú)孵育乳頭肌亦具有正性肌力作用(P<0.01，n=5）；而用3 mmol/L RyR激動(dòng)劑咖啡因（Caffeine，Caf）或10 mmol/L肌漿網(wǎng)鈣泵（Sarco-endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase，

14、SERCA）抑制劑環(huán)匹阿尼酸（Cyclopiazonic acid，CPA）預(yù)處理乳頭肌，則可增加 ADMA對電刺激乳頭肌收縮的抑制作用(P<0.01，n=5）；用3 mmol/L Caf或10 mmol/L CPA單獨(dú)孵育乳頭肌也抑制電刺激乳頭肌收縮（P<0.01，n=5）。
　　2)在體實(shí)驗(yàn)：與正常對照組相比，腹腔注射外源性NOS抑制物L(fēng)-NNA的模型大鼠不僅降低整體心肌收縮力和射血分?jǐn)?shù)降低，而且也降低其離體心肌乳頭肌對電刺激

15、的收縮反應(yīng)，使其發(fā)展張力峰值明顯下降（P<0.05，n=5）；此外，還減少心肌組織RyR2基因轉(zhuǎn)錄（P<0.05，n=5），而采用NO的合成前體 L-Arg體內(nèi)長期治療有逆轉(zhuǎn)這一作用的趨勢，但是沒有顯著性差異。
　　3)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：采用30mmol/L的ADMA孵育H9C2心肌細(xì)胞60 min，既明顯降低H9C2細(xì)胞內(nèi)的基礎(chǔ)Ca2+濃度（P<0.05），也顯著抑制CaCl2刺激所引起的心肌細(xì)胞游離鈣濃度升高（P<0.01，n=5）。