骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及血清濃度對其分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的影響.pdf

1、目的：探討體外分離、純化大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrowmesenchymal stem cells BMSCs)的方法及不同血清濃度對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的影響。動態(tài)觀察其形態(tài)學(xué)變化，并分析血清濃度對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的影響，為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的移植提供實驗依據(jù)。
　　方法：1、選取清潔級4周齡SD大鼠，體重120g～200g。采用密度梯度離心法結(jié)合貼壁篩選法分離純化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并傳

2、代擴增，進行形態(tài)學(xué)觀察，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面抗原的表達(dá)。2、將擴增培養(yǎng)至第3代的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分為6組：第一組(無血清組)，2％B27預(yù)誘導(dǎo)72h后，10ng/mlbFGF+10ng/mlEGF正式誘導(dǎo)，其余各組分別加入1％FBS、2％FBS、5％FBS、10％FBS、20％FBS。在倒置顯微鏡下觀察誘導(dǎo)過程中細(xì)胞的形態(tài)分化，并采用RT-PCR及免疫熒光法對誘導(dǎo)后的細(xì)胞進行鑒定。
　　結(jié)果：1、運用密度梯度離心法結(jié)合貼壁培

3、養(yǎng)法能成功有效地分離純化大鼠BMSCs，并可穩(wěn)定傳代，表型鑒定結(jié)果為CD90、CD29陽性，CD34陰性。2、采用EGF、bFGF可成功誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞分化，誘導(dǎo)過程中細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)生變化。誘導(dǎo)后BMSCs的胞體變圓，折光率增加，并伸出有2～3支或更多突起。RT-PCR示誘導(dǎo)后BMSCs表達(dá)巢蛋白(Nestin)、膠質(zhì)原性纖維酸性蛋白(GFAP)；免疫熒光染色示誘導(dǎo)后神經(jīng)細(xì)胞的標(biāo)志物神經(jīng)烯醇化酶(NSE)以及GFAP表達(dá)陽性。3

4、、BMSCs經(jīng)誘導(dǎo)完成分化后，2％血清組NSE顯色最多，GFAP最少，而20％血清組NSE顯色最少，2％血清組細(xì)胞平均分化率為27.25％，20％血清組平均分化率為13.25％。體外誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞分化時，2％血清濃度可起促進作用，而高濃度血清則起抑制作用。
　　結(jié)論：密度梯度離心法結(jié)合貼壁篩選法可以有效地體外分離純化、培養(yǎng)擴增BMSCs，并能穩(wěn)定傳代培養(yǎng)。采用EGF/bFGF方案，能成功誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)樣