趨化性細(xì)胞因子CCL3L1與HIV-1易感性和融合蛋白表達(dá)的研究.pdf

1、目的 (1)分析趨化性細(xì)胞因子CCL3L1基因拷貝值中國(guó)漢族健康人和HIV-1感染者中的分布特點(diǎn)，以期闡明趨化性細(xì)胞因子CCL3L1基因拷貝值與HIV-1易感性的相關(guān)性。 (2)克隆人趨化因子CCL3L1基因，表達(dá)并初步純化谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)-CCL3L1融合蛋白。 (3)HIV-1輔助受體CCR5配體人趨化因子CCL3L1進(jìn)行果蠅Schneider-2細(xì)胞融合蛋白表達(dá)，純化后活性分析。 方法

2、 (1)選擇HIV/AIDS患者81例和健康者97例，實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)趨化性細(xì)胞因子CCL3L1基因拷貝值。bDNA法檢測(cè)HIV/AIDS患者的血漿病毒載量，同時(shí)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血CD<,4><'+>T細(xì)胞數(shù)量。 (2)從MCF7細(xì)胞中提取總RNA，采用RT-PCR擴(kuò)增CCL3L1 cDNA基因，克隆入GST融合表達(dá)載體PGEX-4T中，重組載體經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定后，在BL21大腸桿菌中用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，獲得GS

3、T-CCL3L1融合蛋白，采用SDS-PAGE和Westemblot分析表達(dá)產(chǎn)物。 (3)克隆人類(lèi)CCL3L1 cDNA，構(gòu)建CCL3L1表達(dá)載體pMT/BiP/His，獲得S2果蠅細(xì)胞表達(dá)的His-CCL3L1融合蛋白，同時(shí)克隆TpCDNA3．1-flag-CCR5表達(dá)載體，培養(yǎng)了穩(wěn)定表達(dá)flag-CCR5的細(xì)胞株，以檢測(cè)表達(dá)的人趨化因子CCL3L1活性。 結(jié)果 (1)中國(guó)漢族健康人群的CCL3L1平均基因拷貝

4、值為1，應(yīng)用logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)低于漢族健康人群平均拷貝數(shù)者有較高的易感性(OR值為0.501)；應(yīng)用spearman相關(guān)分析，HIV/AIDS人群CCL3L1基因拷貝值與病毒載量呈密切負(fù)相關(guān)性(p=0.000)，HIV/AIDS人群CCL3L1基因拷貝值與CD4T細(xì)胞計(jì)數(shù)密切正相關(guān)(p=0.000)。 (2)經(jīng)測(cè)序、酶切鑒定證明CCL3L1基因已正確插入到PGEX-4T-1中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，表達(dá)出相對(duì)分子質(zhì)量為34

5、000的新生GST-CCL3L1融合蛋白。 (3)成功構(gòu)建人趨化因子CCL3L1融合蛋白真核表達(dá)載體pMT/BiP/His，表達(dá)并純化出CCL3L1融合蛋白，免疫沉淀法檢測(cè)和westem blot法分析發(fā)現(xiàn)純化的CCL3L1融合蛋白能特異性結(jié)合CCR5受體，CC13L1融合蛋白在濃度1 nmol/1到50 nmol/1存在劑量依賴(lài)性，濃度50nmol/1到100 nmol/1沒(méi)有劑量依賴(lài)性。 結(jié)論 (1)趨化性細(xì)