超聲微泡復(fù)合載體的制備及其效率研究-SonoVue與脂質(zhì)體的耦聯(lián).pdf

1、背景與目的：超聲造影劑是一種微氣泡的混懸液,它在臨床上的應(yīng)用明顯提高了超聲診斷的敏感性和特異性。近年來(lái),超聲造影劑的研究發(fā)展非常迅速,是當(dāng)前超聲醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。分子影像學(xué)的發(fā)展,使超聲造影劑在靶向分子成像和靶向治療方面顯示出了很大的發(fā)展和應(yīng)用潛力?；蜣D(zhuǎn)移技術(shù)是疾病基因治療的關(guān)鍵步驟,但是該技術(shù)在安全性、轉(zhuǎn)移效率、靶向性等問(wèn)題上一直未能有突破性進(jìn)展。病毒載體雖然轉(zhuǎn)移效率較高,但是其安全性問(wèn)題不容忽視,相關(guān)報(bào)道發(fā)現(xiàn)病毒載體具有免疫

2、源性和對(duì)宿主細(xì)胞基因的整合可能性;非病毒載體,具有安全、簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn),但是基因轉(zhuǎn)移效率低,難以取得滿意效果。脂質(zhì)體和超聲微泡是常用的非病毒基因轉(zhuǎn)移載體之一,實(shí)驗(yàn)證明,超聲輻照的方法可提高脂質(zhì)體和微泡的基因轉(zhuǎn)移效率,但是其效率和方式尚有待于進(jìn)一步優(yōu)化。第二代超聲造影劑,內(nèi)充以高分子量、低溶解度的氟烷氣體,使微泡在血液中穩(wěn)定時(shí)間較長(zhǎng),其粒徑僅數(shù)微米,經(jīng)外周靜脈注射后可自由通過(guò)組織器官的微循環(huán),檢測(cè)微泡所產(chǎn)生的超聲信號(hào),能得到組織血流灌注信息。

3、目前多種商品化超聲造影劑如SonoVue,已逐漸在臨床上廣泛使用。通過(guò)在造影劑表面結(jié)合特異性配體實(shí)現(xiàn)病灶靶向顯影,或利用微泡攜帶藥物或基因以介導(dǎo)其靶向治療,是第三代超聲造影劑的發(fā)展方向。理想的微泡是能夠同時(shí)具備良好的靶向顯影和靶向治療功能,以提高診療的特異性和準(zhǔn)確性。實(shí)驗(yàn)證明,具有良好顯影效果的微泡其粒徑需達(dá)微米級(jí)別,但是這樣大小的微粒無(wú)法穿透毛細(xì)血管壁,難以攜帶藥物或基因進(jìn)入腫瘤實(shí)質(zhì)內(nèi)發(fā)揮作用。為解決穿透力和顯影效果之間的矛盾,我們將

4、微米級(jí)微泡和納米級(jí)脂質(zhì)體耦聯(lián)起來(lái),以前者實(shí)現(xiàn)靶向顯影功能,后者作為藥物或基因運(yùn)輸載體,當(dāng)該復(fù)合載體經(jīng)血液循環(huán)靶向結(jié)合于靶標(biāo)并得到病灶特異聲像圖后,超聲波定向爆破微泡,便可釋放納米脂質(zhì)體進(jìn)入病灶實(shí)質(zhì)。本研究擬建立商品化造影劑SonoVue和自制脂質(zhì)體耦聯(lián)的方法,并檢測(cè)微泡攜帶脂質(zhì)體的效率,為以脂質(zhì)體-微泡復(fù)合載體作為靶向造影劑及藥物載體的進(jìn)一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)甚至臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　方法：1.觀察SonoVue微泡的一般性質(zhì),用親脂性熒

5、光染料DiI對(duì)微泡進(jìn)行標(biāo)記,熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測(cè)DiI對(duì)脂質(zhì)膜微泡的標(biāo)記效果。2.檢測(cè)SonoVue微泡脂質(zhì)膜DSPE-PEG(2000)Amine的嵌入:通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)DSPE-PEG-FITC對(duì)SonoVue微泡的標(biāo)記效率,評(píng)價(jià)兩親性分子DSPE-PEG(2000)Amine嵌入脂質(zhì)膜微泡壁的效率,并建立以這種方式對(duì)成品脂質(zhì)膜微泡進(jìn)行修飾的方法,為微泡添加可連接其它活性物質(zhì)的橋梁。以生物素化SonoVue微泡的對(duì)親和素包被

6、板的靶向結(jié)合實(shí)驗(yàn),評(píng)價(jià)成品微泡可經(jīng)修飾而具有靶向性。3.脂質(zhì)體與SonoVue微泡的耦聯(lián):采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)-超聲波法制備氨基化熒光脂質(zhì)體,并用激光粒度儀測(cè)定脂質(zhì)體粒徑。二步法戊二醛交聯(lián)脂質(zhì)體和微泡,漂浮法洗滌后得到脂質(zhì)體-微泡復(fù)合物。4.流式細(xì)胞儀檢測(cè)脂質(zhì)體濃度對(duì)復(fù)合載體脂質(zhì)體攜帶率的影響:每200μL的SonoVue微泡混懸液內(nèi)加入150μL的DSPE-PEG(2000)Amine(100μM),并以DSPE-PEG-FITC對(duì)微泡進(jìn)行熒

7、光標(biāo)記,成為氨基化的熒光微泡;分別以0μL~300μL的濃度梯度加入戊二醛-脂質(zhì)體(DiI標(biāo)記)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)微泡的FITC和DiI雙熒光陽(yáng)性率,繪制并分析曲線圖。5.多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)DSPE-PEG(2000)Amine濃度對(duì)復(fù)合載體脂質(zhì)體攜帶率的影響:每200μL的SonoVue微泡混懸液內(nèi)加入0～250μL的DSPE-PEG(2000)Amine溶液(100μM),加入200μL戊二醛-脂質(zhì)體(DiI標(biāo)記),構(gòu)建含不同量DSPE

8、-PEG(2000)Amine的脂質(zhì)體-微泡復(fù)合物,多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)各組微泡熒光強(qiáng)度,并以脂質(zhì)體熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組微泡的脂質(zhì)體攜帶率。6.檢測(cè)超聲造影模式下的微泡時(shí)間-強(qiáng)度變化,以評(píng)價(jià)脂質(zhì)體與微泡的耦聯(lián)、微泡的氨基化對(duì)微泡顯影功能的影響。7.脂質(zhì)體-微泡復(fù)合載體對(duì)體外培養(yǎng)細(xì)胞的作用:使MCF-7和SMMC-7721細(xì)胞與脂質(zhì)體-微泡復(fù)合載體接觸并經(jīng)超聲輻照,觀察熒光脂質(zhì)體進(jìn)入細(xì)胞的情況,并與單脂質(zhì)體和單微泡組細(xì)胞比較。
　　

9、結(jié)果：1.SonoVue微泡的一般形態(tài)顯示良好。親脂性熒光染料DiI成功對(duì)SonoVue微泡標(biāo)記,標(biāo)記濃度5μM時(shí)微泡熒光陽(yáng)性率為(92.31±3.62)％。2.流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示當(dāng)DSPE-PEG-FITC(100μM)的濃度為20μL/mL時(shí),微泡熒光陽(yáng)性率達(dá)(94.7±6.4)%,為最佳濃度。生物素化微泡的親和素靶向性實(shí)驗(yàn)顯示洗滌后生物素化微泡保留在親和素包被板上的數(shù)目明顯多于未生物素化微泡。3.旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)-超聲波法成功制備熒光

10、脂質(zhì)體,平均粒徑為272.6nm;并以戊二醛交聯(lián)法成功耦聯(lián)脂質(zhì)體和微泡。4.流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示每200μL的SonoVue微泡混懸液內(nèi)加入200μL脂質(zhì)體,熒光陽(yáng)性率達(dá)峰值(87.80±5.91)%。5.多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)結(jié)果顯示每200μL的SonoVue微泡混懸液內(nèi)加入150μL的DSPE-PEG(2000)Amine,脂質(zhì)體攜帶率達(dá)(83.41±2.21)%,提高DSPE-PEG(2000)Amine的量,并不能提高脂質(zhì)體攜帶率

11、。6.超聲造影模式下微泡的時(shí)間-強(qiáng)度變化顯示,氨基化微泡與原始微泡聲強(qiáng)下降速度之間的差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但是脂質(zhì)體的耦聯(lián)使其聲強(qiáng)下降速度增快,與原始微泡比較,兩者之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。7.與單脂質(zhì)體和單微泡組細(xì)胞比較,MCF-7和SMMC-7721細(xì)胞與脂質(zhì)體-微泡復(fù)合載體接觸并經(jīng)超聲輻照后,細(xì)胞內(nèi)熒光信號(hào)明顯增多。
　　結(jié)論：商品化造影劑SonoVue微泡可通過(guò)嵌入DSPE-PEG(2000)A

12、mine分子實(shí)現(xiàn)氨基化,脂質(zhì)體作為藥物或基因的運(yùn)輸體,在脂質(zhì)體膜成分中加入具有活性氨基的磷脂,可以戊二醛交聯(lián)法實(shí)現(xiàn)氨基化微泡和脂質(zhì)體的耦聯(lián)。而且我們可通過(guò)改變修飾微泡及脂質(zhì)體的活性基團(tuán),選擇能獲得更高的耦聯(lián)效率及更簡(jiǎn)便的制備方法。利用靶向微泡作為顯影手段及靶向載體時(shí),往往需要在構(gòu)建微泡的過(guò)程中根據(jù)不同的疾病添加靶向分子及藥物,如此就要制備多種微泡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示只需制備一種微泡,在微泡成品后添加不同的靶向分子及含不同藥物、基因的脂質(zhì)體,