毛竹SSR位點(diǎn)引物開發(fā)及部分竹種系統(tǒng)學(xué)分析.pdf

1、竹類植物是禾本科一個(gè)最大的自然類群，具有70余屬，1200余種。竹子不僅具有生長(zhǎng)快，用途廣等特性，而且還具有良好的水源涵養(yǎng)和水土保持等環(huán)境功能。竹類植物通常難以開花，而且一旦開花，植株乃至全林即全部枯死，因而傳統(tǒng)的以花、果實(shí)形態(tài)為主的分類方法對(duì)竹類植物十分困難。目前竹子的分類依然存在著很多爭(zhēng)議，而分子標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用為竹子系統(tǒng)分類的深入開展提供了新的依據(jù)。SSR(Simple Sequence Repeat)簡(jiǎn)單序列重復(fù)，又稱為微衛(wèi)星，這

2、類分子標(biāo)記具有含量豐富，多態(tài)程度高，檢測(cè)方法簡(jiǎn)便，不受環(huán)境和基因表達(dá)影響等特點(diǎn)，在種質(zhì)鑒定、遺傳多樣性分析以及系譜分析中成為一種理想的分子標(biāo)記。目前，竹類植物的微衛(wèi)星引物開發(fā)國(guó)內(nèi)外報(bào)道較少，無(wú)法滿足竹子系統(tǒng)研究的需要。
　　本研究通過磁珠富集法開發(fā)了31對(duì)毛竹SSR引物并對(duì)部分竹類植物進(jìn)行了系統(tǒng)分類學(xué)研究。主要結(jié)果如下：
　　1通過磁珠富集，成功構(gòu)建了毛竹基因組DNA的GT、AG、CCA重復(fù)序列的富集文庫(kù)，利用克隆PCR方法

3、共檢測(cè)了2330個(gè)克隆，三個(gè)文庫(kù)分別檢測(cè)菌落數(shù)為1080、620、630個(gè)，陽(yáng)性克隆分別為219、113、119個(gè)，陽(yáng)性率為19.4％(451/2330)；
　　2獲得350條非冗余序列，長(zhǎng)度范圍在61~831bp之間，平均為288bp，序列總長(zhǎng)為100704bp，占毛竹基因組大小約1/20000；發(fā)現(xiàn)重復(fù)位點(diǎn)641個(gè)，重復(fù)次數(shù)在3～54次之間，其中重復(fù)3、4、5、6、7、8、9、10、>10次的位點(diǎn)數(shù)分別為415、86、37、1

4、4、19、8、12、11、39個(gè)；雙核苷酸重復(fù)位點(diǎn)最多，為521個(gè)，三核苷酸、四核苷酸位點(diǎn)數(shù)分別為108、35個(gè)；
　　3對(duì)獲得序列進(jìn)行 Blast比對(duì)，結(jié)果顯示：所得序列與 GenBank登錄序列的毛竹基因序列相似數(shù)最多，為63條，與水稻、甜高粱、小麥、玉米序列相似數(shù)分別為28、11、3、3條，這與毛竹的基因組進(jìn)化地位相吻合；
　　4設(shè)計(jì)合成了53對(duì)SSR引物，以毛竹基因組DNA為模板對(duì)這些引物是否工作進(jìn)行了檢測(cè)，其中34

5、對(duì)引物擴(kuò)增出了預(yù)期大小的條帶，利用溫度梯度PCR確定了各引物最適退火溫度；
　　5用熒光標(biāo)記物FAM對(duì)34對(duì)引物中的正向引物進(jìn)行標(biāo)記，利用毛細(xì)管電泳分析9份毛竹種內(nèi)樣品SSR-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小，其中引物對(duì)27、36、40的擴(kuò)增產(chǎn)物中具有非預(yù)期大小的片段，對(duì)這三對(duì)引物擴(kuò)增黃槽毛竹的PCR產(chǎn)物進(jìn)行了克隆和序列分析，發(fā)現(xiàn)這些位點(diǎn)存在序列重復(fù)；利用其余31個(gè)位點(diǎn)對(duì)9份毛竹種內(nèi)樣品進(jìn)行位點(diǎn)特征分析，發(fā)現(xiàn)31個(gè)位點(diǎn)在除黃槽毛竹的8個(gè)毛竹樣

6、品中都有預(yù)期大小的等位基因的擴(kuò)增，而黃槽毛竹的位點(diǎn)特征與其他8個(gè)毛竹樣品具有較大差異，其中位點(diǎn)2、17、38、42、50對(duì)黃槽毛竹顯示零等位，位點(diǎn)8、13、15、18、21、24、28、31、32、33、37、41、43、46、49、51具有不同于其他8個(gè)毛竹樣品的特殊等位基因，這些差異位點(diǎn)占總位點(diǎn)數(shù)的61.8%(5+16/34)；
　　6對(duì)除黃槽毛竹的8份毛竹樣品的31個(gè)SSR位點(diǎn)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：有18個(gè)位點(diǎn)在所有8份毛竹樣

7、品中都只擴(kuò)增出了一個(gè)大小相同的片段，其余13個(gè)位點(diǎn)的擴(kuò)增條帶具有差異，表現(xiàn)出了多態(tài)性；這31個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)(ObservedNumber ofAlleles,Na)在1~3個(gè)之間，平均為1.548個(gè)；有效等位基因數(shù)(EffectiveNumber ofAlleles,Ne)在1~2.65之間，平均有效等位基因數(shù)為1.375個(gè)；這些位點(diǎn)的觀測(cè)雜合度(Observed Heterozygosities, Ho)在0~1之間，平均為0.3

8、09；期望雜合度(Expeeted Heterozygosities，He)在0~0.67之間，平均為0.201；多態(tài)信息含量在0~0.575之間，平均為0.147；13個(gè)多態(tài)位點(diǎn)中只有1個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)信息含量在0.5以上，其余12個(gè)位點(diǎn)在0.110~0.48之間，平均為0.352，多態(tài)信息含量較低，這些都表明毛竹種內(nèi)遺傳差異較小，基因突變程度較低；
　　7對(duì)唐竹屬、業(yè)平竹屬、大節(jié)竹屬的11個(gè)竹種的31個(gè) SSR位點(diǎn)進(jìn)行了分析，檢測(cè)

9、結(jié)果用 NTsys軟件計(jì)算竹種間的Nei氏遺傳距離(Nei's Distance)，非加權(quán)算數(shù)平均法(UnweightedPair-groupMethod withArithmeticMeans)對(duì)遺傳距離矩陣進(jìn)行聚類分析，結(jié)果顯示31個(gè)SSR位點(diǎn)可以將這11個(gè)竹種分為三個(gè)屬區(qū)；
　　8對(duì)剛竹屬內(nèi)51份樣品的31個(gè)SSR位點(diǎn)進(jìn)行了分析，聚類結(jié)果表明：符合傳統(tǒng)分類學(xué)方法，說明這些SSR位點(diǎn)可以為剛竹屬植物屬內(nèi)的分類提供參考；各竹種種