利用親和素磁珠法開(kāi)發(fā)毛竹SSR引物.pdf

1、微衛(wèi)星或簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeats，SSR）近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新的DNA分子標(biāo)記，因其具有保守性、高多態(tài)性、共顯性等特點(diǎn)，是毛竹（Phylbstachys pubescens）基因組研究不可或缺的一種重要工具。磁珠富集法是一種快速、高效分離微衛(wèi)星分子標(biāo)記的方法。本研究在參考其它文獻(xiàn)報(bào)道的基礎(chǔ)上，通過(guò)優(yōu)化親和素磁珠技術(shù)構(gòu)建毛竹基因組SSR位點(diǎn)富集文庫(kù)。
　　 在文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程中，用EcoRⅠ分別和

2、DraⅠ、EcoRⅤ、SmaⅠ、PvuⅡ四種平端限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)毛竹基因組DNA進(jìn)行雙酶切，酶切片段回收后與根據(jù)抑制性PCR原理設(shè)計(jì)的接頭連接。在利用親和素磁珠富集含有SSR序列的DNA片段過(guò)程中，對(duì)雜交、漂洗及洗脫步驟進(jìn)行優(yōu)化?；厥债a(chǎn)物經(jīng)PCR擴(kuò)增及轉(zhuǎn)化后，得到約2000個(gè)克隆。通過(guò)三引物特異PCR篩選，得到約300個(gè)含有SSR位點(diǎn)的陽(yáng)性克隆，文庫(kù)的陽(yáng)性克隆率為19％左右，依據(jù)陽(yáng)性克隆率并結(jié)合測(cè)序結(jié)果對(duì)富集SSR文庫(kù)進(jìn)行評(píng)價(jià)，確定了一條

3、簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、高效分離竹類(lèi)植物SSR標(biāo)記的方法。對(duì)其中150個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序并分析，AG重復(fù)占到96.3％，AC重復(fù)占到4.7％。將其中62個(gè)SSR重復(fù)次數(shù)大于8次，并且位置居中的序列提交到GenBank并將其進(jìn)行歸類(lèi)。其中復(fù)合型的微衛(wèi)星共9個(gè)占16.3％，完美型的35個(gè)占56.3％，非完美型的27個(gè)占43.7％。SSR重復(fù)數(shù)在10次以下的為11個(gè)，重復(fù)10-20次的為37個(gè)，重復(fù)20次以上的為14個(gè).
　　 根據(jù)序列設(shè)計(jì)SSR