C5-siRNA對(duì)大鼠心肌缺血損傷的保護(hù)作用.pdf

1、研究背景：
　　 心肌缺血再灌注(myocardial ischemia and reperfusion，MI/R)損傷是指缺血心肌組織在恢復(fù)血液灌注后發(fā)生的細(xì)胞死亡或功能降低。在缺血與再灌注的過程中，尤其是再灌早期，大量補(bǔ)體迅速激活，其激活劑不僅包括抗原抗體復(fù)合物、粘多糖、組織蛋白酶、病毒、細(xì)菌、特異性哺乳動(dòng)物細(xì)胞、免疫球蛋白聚合體，而且缺血心肌細(xì)胞線粒體本身就可釋放一些特異性分子經(jīng)經(jīng)典途徑激活補(bǔ)體系統(tǒng)，補(bǔ)體激活級(jí)聯(lián)反應(yīng)的終產(chǎn)

2、物一攻膜復(fù)合物(C5b-9)和多聚C9沉積在缺血區(qū)，與心肌梗死面積有直接關(guān)系，是導(dǎo)致細(xì)胞死亡的直接因素。因此，針對(duì)特異性補(bǔ)體成分C5的治療，在C5水平抑制補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)以阻止膜攻擊復(fù)合物的形成和過敏毒素C5a的產(chǎn)生，而仍維持重要補(bǔ)體功能，如調(diào)理和免疫復(fù)合物清除等，具有重要意義。
　　 RNA干擾(RNA interference，RNAi)是近年發(fā)展起來(lái)的研究轉(zhuǎn)錄后剪切的-種實(shí)驗(yàn)方法。它將目的基因所對(duì)應(yīng)的雙鏈RNA導(dǎo)入生物體，導(dǎo)致

3、相應(yīng)的mRNA降解，從而使目的基因沉默。我們?cè)诒緦?shí)驗(yàn)中利用RNA干擾技術(shù)選擇性阻斷了補(bǔ)體晚期激活產(chǎn)物C5的表達(dá)而抑制補(bǔ)體激活，這樣既可達(dá)到減輕心肌損傷的目的，又可保留機(jī)體必要的免疫功能。
　　 目的：
　　 本課題分為四部分，研究采用RNA干擾技術(shù)，通過沉默C5補(bǔ)體激活產(chǎn)物的表達(dá)而抑制心肌缺血區(qū)補(bǔ)體的激活，進(jìn)而探討其對(duì)心肌缺血再灌注的影響。
　　 (1)構(gòu)建小鼠C5基因特異性siRNA慢病毒載體，并對(duì)其進(jìn)行功能性

4、研究。(2)改進(jìn)和完善大鼠急性心肌缺血再灌注損傷動(dòng)物模型的制備及評(píng)估。(3)研究C5-siRNA對(duì)大鼠心肌缺血的保護(hù)作用。(4)觀察C5-siRNA對(duì)大鼠心肌缺血的心肌組織病理學(xué)的影響。
　　 方法：
　　 (1)選取C5基因的19nt特異性序列，設(shè)計(jì)針對(duì)C5的siRNA序列，應(yīng)用基因重組技術(shù)插入到pGCSIL-GFP慢病毒表達(dá)載體中，Age I和EcoR I進(jìn)行雙酶切和DNA測(cè)序鑒定重組克隆，重組病毒質(zhì)粒及其3種輔助包

5、裝原件載體質(zhì)粒通過Lipofectamine 2000共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，培養(yǎng)48h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，將其濃縮后在293細(xì)胞中測(cè)定病毒滴度。
　　 (2)健康SD大鼠隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組(Sham組)，僅穿線，不結(jié)扎LAD；缺血組(Ischemia組)，單純結(jié)扎LAD30min；缺血再灌注組(IR組)，結(jié)扎LAD30min，再灌注120min。每組20只。并從造模成功率、心電圖、外周血中LDH、CK-MB的含量測(cè)定、心肌

6、病理組織學(xué)檢查等方面對(duì)改進(jìn)后的模型進(jìn)行評(píng)估。
　　 (3)30只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham組)，對(duì)照組(Control組)和C5-siRNA干預(yù)組。結(jié)扎對(duì)照組和干預(yù)組大鼠的冠狀動(dòng)脈前降支近端制備急性大鼠心肌缺血模型，予冠脈前降支支配的中心區(qū)分別注射生理鹽水和C5-siRNA，1小時(shí)后松扎，測(cè)定血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)，心電圖改變及血清LDH和CK-MB變化。
　　 (4)30只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham組)，模型組

7、(Ischemia組)和C5-siRNA干預(yù)組。結(jié)扎模型組和干預(yù)組大鼠的冠狀動(dòng)脈前降支近端制備急性大鼠心肌缺血模型，予冠脈前降支支配的中心區(qū)分別注射生理鹽水和C5-siRNA，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后測(cè)定心臟指數(shù)，光鏡觀察心肌形態(tài)學(xué)改變及C5的免疫組織化學(xué)染色。
　　 結(jié)果：
　　 (1)通過對(duì)pGCSIL-GFP-C5-siRNA載體進(jìn)行雙酶切鑒定，證實(shí)短發(fā)夾RNA正確插入慢病毒載體。DNA測(cè)序證實(shí)插入的序列正確，C5基因RNA干擾

8、重組慢病毒載體經(jīng)293細(xì)胞包裝成功，收集293細(xì)胞分泌的病毒上清測(cè)定病毒的滴度為5×107U/mL。
　　 (2)改進(jìn)后的造模成功率達(dá)到90％以上，血液動(dòng)力學(xué)、心電圖、外周血中LDH、CK-MB的含量測(cè)定、心肌病理組織學(xué)檢查等方式均證實(shí)改良后的動(dòng)物模型成功。
　　 (3)C5-siRNA對(duì)心肌缺血損傷大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)均有一定的改善趨勢(shì)；C5-siRNA能縮小大鼠結(jié)扎冠脈后心電圖缺血范圍(N-ST)及心肌缺血程度(ST段

9、位移值)，減輕病理學(xué)損傷；對(duì)嚴(yán)重的心肌缺血引起的血清LDH和CK-MB升高也有明顯降低作用，尤其是其中CK-MB與模型組相比差異顯著(1109±245 U/L vs 1513±335 U/L)(P<0.05)。
　　 (4)C5-siRNA對(duì)心肌缺血損傷大鼠的心臟指數(shù)沒影響，C5-siRNA能減輕心肌缺血的病理學(xué)損傷。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，模型組與干預(yù)組的C5表達(dá)量均明顯高于假手術(shù)組(P<0.001)，而干預(yù)組的C5表達(dá)量雖與模

10、型對(duì)照組相比有所降低，但二者沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差別(P=0.132)。
　　 結(jié)論：
　　 (1)成功構(gòu)建小鼠C5 siRNA曼病毒載體，為研究C5在心肌缺血再灌注損傷中的影響提供了穩(wěn)定感染細(xì)胞載體。
　　 (2)改進(jìn)后的方法能大大降低手術(shù)難度，提高模型成功率和動(dòng)物成活率，準(zhǔn)確地復(fù)制心肌缺血再灌注損傷的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，?jiǎn)化實(shí)驗(yàn)操作步驟。
　　 (3)C5-siRNA對(duì)大鼠急性心肌缺血具有保護(hù)作用。