組織靶向肝素-SOD及季銨化殼聚糖-SOD結(jié)合物的制備及其對ROS誘導(dǎo)損傷的作用與機制研究.pdf

1、活性氧族（reactive oxygen species，ROS），例如超氧陰離子自由基（（））和H2O2等都能造成機體氧化性應(yīng)激反應(yīng)，成為許多疾病比如肝損傷、肺損傷的誘導(dǎo)因子。超氧化物歧化酶（SOD）能夠分解（），從而可防御由于氧化應(yīng)激反應(yīng)造成的損傷。然而體內(nèi)試驗卻表明，SOD在抗炎、抗纖維化中發(fā)揮的作用不夠理想，需要的劑量較大。造成SOD在動物實驗和臨床試驗療效不理想的原因是由于SOD不理想的藥代動力學(xué)特點，即體內(nèi)半衰期短（t1/2

2、大約6min）。為了改善SOD的藥代動力學(xué)性質(zhì)，提高SOD的作用效果，本文設(shè)計研究了具有長效和組織或者細(xì)胞靶向性SOD，即用陰離子多糖肝素修飾的SOD（Hep-SOD）和用陽離子多糖N，N，N-三甲基季銨化殼聚糖（TMC）修飾的SOD（TMC-SOD），及它們的理化與生物學(xué)性質(zhì)和對ROS引起的損傷的作用與機制。 本論文的主要研究內(nèi)容與結(jié)果如下。 1 Hep-SOD與TMC-SOD的制備 采用高碘酸鈉氧化法活化肝素

3、，用活化的肝素在pH9.5、0.3 mol/L碳酸鹽溶液中對SOD進行化學(xué)修飾，反應(yīng)產(chǎn)物通過電泳鑒定。對該修飾反應(yīng)液進行預(yù)處理后，用DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換柱層析進行修飾酶的分級分離，制備Hep-SOD結(jié)合物。 EDC（1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺）縮合法制備TMC-SOD。為增加殼聚糖的水溶性和陽電荷性質(zhì)，先將殼聚糖用H2O2法降解，再通過N-位三甲基化，得到TMC。TMC在縮合

4、劑EDC的存在下對SOD進行修飾，得到TMC-SOD，修飾反應(yīng)液進行預(yù)處理后，用DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換柱層析進行修飾酶的分級分離得到TMC-SOD結(jié)合物。 SOD活性測定結(jié)果表明，天然SOD、TMC-SOD以及Hep-SOD酶活分別為3250、2830和2770 U/mg。采用MTT法測定證實，SOD的兩種結(jié)合物均無細(xì)胞毒性。 2 Hep-SOD、TMC-SOD的二級結(jié)構(gòu)分析

5、采用圓二色譜法（CD）對SOD及其修飾物的二級結(jié)構(gòu)進行研究，并比較其差別。結(jié)果顯示，在溶液狀態(tài)SOD與其兩種結(jié)合物的CD圖譜略有差異。具體來講，Hep-SOD比未修飾的SOD分子結(jié)構(gòu)中α-helix比例增加（24.50％vs23.50％），而β-sheet的含量降低（48.3％ vs49.8％），同時，Random. Coil成分比例均略有下降（30.80％ vs31.90％）。研究表明，SOD經(jīng)過TCM修飾以后在二級結(jié)構(gòu)上也發(fā)生了一定

6、的變化，主要表現(xiàn)在α-helix降低（20.70％ vs23.50％）；β-構(gòu)象的含量升高（53.7％ vs49.8％），同時，Random. Coil的含量升高（37.90％ vs31.90％）。但總體而言，SOD經(jīng)過修飾前后對二級結(jié)構(gòu)的影響都不大，這與修飾前后對SOD酶活的影響不大一致。 3 SOD結(jié)合物對巨噬細(xì)胞的靶向性研究 3.1 SOD結(jié)合物對細(xì)胞內(nèi)SOD酶活、總抗氧能力（T-AOC）、超氧陰離子釋放的影響

7、 本研究考察了SOD結(jié)合物對淀粉誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)SOD酶活力和T-AOC以及對抑制（）釋放的影響。結(jié)果顯示，正常小鼠腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)SOD酶活性為48.34±5.39 U/mg蛋白，巨噬細(xì)胞與各用藥組共同孵育以后細(xì)胞內(nèi)酶活性均升高，其中SOD組細(xì)胞內(nèi)酶活升高到62.92±6.00 U/mg蛋白，與正常細(xì)胞內(nèi)酶活相比差異不顯著（P>0.5），而Hep-SOD組和TMC-SOD組細(xì)胞內(nèi)酶活性升高均非常顯著，分別達(dá)到162.2±7.

8、20和408.04±15.91 U/mg蛋白，與正常細(xì)胞內(nèi)酶活相比具有顯著性差異（P<0.01）。結(jié)果還表明，正常小鼠腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)T-AOC為9.50±1.49 U/mg蛋白，巨噬細(xì)胞與各用藥組共同孵育以后細(xì)胞T-AOC均升高，SOD組細(xì)胞內(nèi)T-AOC升高到11.89±2.28 U/mg蛋白，與正常細(xì)胞內(nèi)T-AOC相比差異不顯著（P>0.5），而Hep-SOD組和TMC-SOD組細(xì)胞內(nèi)T-AOC升高非常顯著，分別達(dá)到32.39±2.9

9、4 U/mg蛋白和71.36±5.35 U/mg蛋白（P<0.01）。研究顯示，Hep-SOD和TMC-SOD均能夠抑制巨噬細(xì)胞（）的釋放，影響趨勢與各用藥組對細(xì)胞內(nèi)SOD酶活性的影響變化趨勢基本一致，TMC-SOD用藥組的抑制作用顯著高于其他用藥組。 3.2流式細(xì)胞技術(shù)檢測SOD結(jié)合物對巨噬細(xì)胞的結(jié)合能力 本研究借助流式細(xì)胞儀檢測考察SOD及其兩種結(jié)合物對巨噬細(xì)胞的結(jié)合能力。FITC標(biāo)記的SOD、Hep-SOD以及TM

10、C-SOD與小鼠腹腔巨噬細(xì)胞共同孵育，結(jié)果表明，TMC-SOD對細(xì)胞的結(jié)合能力最強，其次是Hep-SOD，陽性率分別為95.36％和29.2％，而SOD孵育組陽性率只有22％；當(dāng)延長孵育時間達(dá)到2h，陽性率均升高，其中SOD、Hep-SOD組分別升高到37.64％和51.81％。 3.3激光共聚焦顯微鏡技術(shù)研究SOD及其修飾物巨噬細(xì)胞內(nèi)分布 FITC標(biāo)記的SOD及SOD衍生物與巨噬細(xì)胞共孵育1 h后，SOD組的熒光信號

11、較弱，而Hep-SOD組和TMC-SOD組的熒光信號與SOD組相比有不同程度的增強，其中，Hep-SOD組熒光略強于SOD組。FITC標(biāo)記的SOD及SOD衍生物與巨噬細(xì)胞共孵育2h后，熒光強度均比1h時的相同藥物組有不同程度的增強，且兩個修飾物組均表現(xiàn)出比SOD組更強的熒光強度。 4 Hep-SOD結(jié)合物對CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷和肝纖維化的防治作用 4.1 Hep-SOD結(jié)合物對CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷的作用

12、本研究采用CCl4腹腔注射誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷，立即尾靜脈注射給藥。用藥24 h取血測定血清LDH、GSH和GOT/GPT活性；取肝組織測定MDA含量。結(jié)果顯示，Hep-SOD以及Hep+SOD組轉(zhuǎn)氨酶濃度均低于模型組，但高于正常對照組。結(jié)果還顯示腹腔注射CCl4不僅導(dǎo)致血液GOT/GPT、LDH以及肝組織MDA濃度升高，還同時降低GSH的濃度。研究發(fā)現(xiàn)，尾靜脈注射Hep-SOD能夠顯著降低LDH，同時增高GSH的濃度。各生化指標(biāo)顯示，與

13、天然SOD相比，Hep-SOD保肝作用更為顯著，Hep-SOD對CCl4誘導(dǎo)的急性壞死性肝損傷具有很理想的預(yù)防和保護作用。肝素用藥組在本實驗中沒發(fā)現(xiàn)有明顯的療效。 4.2 Hep-SOD結(jié)合物對CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化的防治作用 本研究采用CCl4腹腔注射，每周2次，連續(xù)12周誘導(dǎo)小鼠肝纖維化，在CCl4注射后立即腹腔注射給藥，最后一次用藥24 h后眼球取血處死動物，進行以下實驗。 （1）羥脯氨酸測定 （2）肝

14、臟病理學(xué)檢測 （3）Hep-SOD對小鼠肝組織相關(guān)mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響 （4）Hep-SOD對小鼠肝組織TGF-β1蛋白表達(dá)水平的影響 5 TMC-SOD結(jié)合物對CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷和肝纖維化的防治作用 5.1 TMC-SOD對急性肝損傷的保護作用 采用對CCl4注射的小鼠尾靜脈注射TMC-SOD。用藥后24 h取血處死，測定血液生化指標(biāo)GOT/GPT、GSH、LDH以及肝組織中MDA含量。結(jié)果

15、顯示，CCl4誘導(dǎo)急性肝損傷通過降低GSH水平、提高脂質(zhì)過氧化來改變組織氧化還原狀態(tài)。而上述變化在TMC-SOD用藥組以及TMC+SOD用藥組均得到部分抑制。各生化指標(biāo)顯示，與其他用藥組相比，TMC-SOD組對急性肝損傷的改善作用最顯著。 5.2 TMC-SOD對肝纖維化的保護作用 本研究采用TMC-SOD和CCl4同時腹腔注射小鼠，每周兩次，連續(xù)12周。組織病理學(xué)以及羥脯氨酸含量測定均表明TMC-SOD能夠有效防治肝纖

16、維化。本研究還采用RT-PCR測定TGF-β1、MMP-2以及collagen-I等的mRNA。測定結(jié)果顯示，CCl4連續(xù)注射12周能夠使上述mRNA顯著升高，而TMC-SOD用藥組能夠有效降低上述mRNA水平。 本研究取得的主要結(jié)論: （1）成功制備分離得到了Hep-SOD和TMC-SOD兩種多糖結(jié)合物，并借助CD技術(shù)對兩種結(jié)合物二級結(jié)構(gòu)進行了分析，發(fā)現(xiàn)該制備過程對SOD二級結(jié)構(gòu)影響不大。 （2）聚陰離子黏多糖--

17、肝素以及聚陽離子黏多糖--TMC是較理想的巨噬細(xì)胞靶向性修飾劑，其中TMC的靶向性修飾效果更好。 （3）Hep-SOD通過升高GSH的濃度和降低TGF-β1的表達(dá)，能夠防治CCl4造成的急性肝損傷和肝纖維化，該防治作用可能是結(jié)合物的抗氧化作用和抗炎作用共同作用的結(jié)果。 （4）TMC-SOD結(jié)合物防治急性肝損傷和肝纖維化作用顯著。TMC-SOD將有望成為治療由于氧化應(yīng)激作用導(dǎo)致的肝纖維化和急性肝損傷的有效藥物。 （5）與