以蓖麻蠶為模型研究1-DNJ對(duì)糖代謝等關(guān)鍵代謝通路的影響.pdf

1、自古以來(lái)，桑葉是家蠶的主要食物來(lái)源，卻不是蓖麻蠶的天然宿主，其乳汁中富含的防御蛋白MLX56和1-脫氧野尻霉素（DNJ）等生物堿卻對(duì)蓖麻蠶和甘藍(lán)夜蛾等食草性昆蟲(chóng)有致命毒性，而家蠶對(duì)桑乳汁的毒性存在獨(dú)特的適應(yīng)性機(jī)制。蓖麻蠶已被利用于發(fā)現(xiàn)和評(píng)估植物對(duì)食草昆蟲(chóng)的防御應(yīng)答，因此我們選擇蓖麻蠶作為實(shí)驗(yàn)昆蟲(chóng)，來(lái)評(píng)估短期添食DNJ對(duì)非食桑昆蟲(chóng)的毒理及作用分析。
　　1-DNJ是一種天然的 D-葡萄糖類似物，在生物體內(nèi)有很強(qiáng)的生理活性。它能抑制小

2、腸和肝臟內(nèi)的α-葡萄糖甘酶，延遲血管的衰老和削弱膽固醇代謝?；贒NJ的潛在藥用價(jià)值，富含DNJ的天然產(chǎn)物可以作用口服治療糖尿病的藥物，在許多國(guó)家的市場(chǎng)上已經(jīng)出現(xiàn)了各種含有 DNJ成分的藥品。以往的研究往往著重于DNJ在小鼠或者其他哺乳動(dòng)物上的抗糖尿病作用，而鮮有DNJ作用于昆蟲(chóng)，隨之引起的具體的生理機(jī)制改變和毒性反應(yīng)等方面的報(bào)道。
　　核磁共振（NMR）能對(duì)樣品實(shí)現(xiàn)無(wú)破壞性、無(wú)選擇性和無(wú)偏向的分析，實(shí)驗(yàn)方法靈活多樣，可在接近生理

3、條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)?；贜MR的代謝組學(xué)分析方法作為當(dāng)前代謝組學(xué)研究中的主要技術(shù)之一，比較適合病理研究和藥物作用后改善機(jī)制研究，也很適合研究代謝產(chǎn)物中的復(fù)雜成分。本研究中運(yùn)用代謝組學(xué)技術(shù)研究DNJ作用于蓖麻蠶體內(nèi)的代謝調(diào)控機(jī)制，有助于從整體上闡明DNJ引起糖代謝、能量代謝等通路變化的生理機(jī)制。同時(shí)結(jié)合轉(zhuǎn)錄組技術(shù)及RT-qPCR驗(yàn)證，鑒定蓖麻蠶糖代謝和能量代謝相關(guān)的酶以及代謝途徑，結(jié)合代謝組學(xué)數(shù)據(jù)，分析蓖麻蠶添食DNJ后，催化糖代謝和能量代謝

4、的關(guān)鍵酶基因的差異表達(dá)情況。
　　主要結(jié)果如下：
　　1. DNJ對(duì)蓖麻蠶的毒理分析：4齡起蓖麻蠶添食5μl的H2O、0.25％ DNJ、0.5%DNJ、乳汁和混合物（0.5%DNJ與乳汁1:1混合），每天一次，連續(xù)喂食2天，在第3天只有乳汁組發(fā)生了蓖麻蠶的死亡，死亡率高達(dá)40%。為了進(jìn)一步驗(yàn)證DNJ對(duì)蓖麻蠶的毒性，取5齡起蓖麻蠶分別添食5μl的H2O、1%和2%DNJ，每天一次持續(xù)3天，無(wú)蓖麻蠶死亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明：短期添食

5、0.25-2%DNJ對(duì)蓖麻蠶無(wú)明顯的毒理反應(yīng)，乳汁中的UHMWs和防御蛋白MLX56很可能是使蓖麻蠶致死的主要因素，且有濃度依賴性。
　　2.基于NMR的代謝組學(xué)技術(shù)，分析DNJ引起蓖麻蠶的血淋巴、中腸和脂肪體組織內(nèi)的糖代謝及能量代謝途徑的變化。我們把得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行模式識(shí)別及代謝物定量分析，結(jié)果顯示不同濃度的 DNJ均可引起蓖麻蠶的血淋巴、中腸和脂肪體組織的顯著代謝輪廓差異。定量分析得知，添食 DNJ后，血淋巴中海藻糖、乳酸和丙氨

6、酸濃度上調(diào)，琥珀酸、檸檬酸、蘋果酸和延胡索酸這些TCA循環(huán)的中間產(chǎn)物濃度降低，意味著海藻糖水解、糖異生和TCA循環(huán)水平降低，糖酵解途徑增強(qiáng)，同時(shí)參與其中的催化酶活性改變；中腸和脂肪體中海藻糖水解和TCA循環(huán)途徑受抑制。
　　3.以轉(zhuǎn)錄組技術(shù)分析5齡起蓖麻蠶添食DNJ和對(duì)照添水組后，獲得了蓖麻蠶轉(zhuǎn)錄組的基本信息，發(fā)現(xiàn)添食DNJ后蓖麻蠶體內(nèi)表達(dá)顯著上調(diào)的unigenes有577條，下調(diào)表達(dá)的 unigenes有288條。進(jìn)一步分析添食

7、2%DNJ后催化糖代謝和能量代謝的關(guān)鍵酶基因的差異表達(dá)情況，結(jié)果顯示，添食 DNJ后活性很可能改變的琥珀酸脫氫酶、延胡索酸酶、蘋果酸脫氫酶和海藻糖酶的25條 unigenes表達(dá)無(wú)差異。活性受抑制的葡萄糖苷酶的5條相關(guān)unigenes表達(dá)上升。
　　4.根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，我們獲得了蓖麻蠶糖代謝和能量代謝相關(guān)酶基因的信息。本文采用相對(duì)定量 PCR的方法，測(cè)定蓖麻蠶血淋巴內(nèi)海藻糖酶和葡萄糖苷酶基因的mRNA表達(dá)。2條海藻糖酶基因：tre

8、halase-1B和trehalase-2在蓖麻蠶添食1%和2% DNJ后6-48h，表達(dá)與對(duì)照組無(wú)差異。3條葡萄糖苷酶基因中α-glucosidase基因在蓖麻蠶添食2% DNJ后12h顯著上調(diào)，glucosidaseⅡβsubunit基因在蓖麻蠶添食2%DNJ后6-12h表達(dá)升高，uncharacterized family31 glucosidase基因在不同時(shí)間點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間表達(dá)無(wú)差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組的基因差異表達(dá)分析