HBsAg定量在慢性HBV感染者肝纖維化預(yù)測(cè)中的價(jià)值及二甲雙胍對(duì)HBsAg表達(dá)的抑制和初步機(jī)制.pdf

1、作為乙型肝炎病毒(HBV)的外膜蛋白，乙型肝炎表面抗原(HBsAg)血清檢測(cè)是確立HBV感染診斷的傳統(tǒng)標(biāo)志物，隨著檢測(cè)技術(shù)的改進(jìn)和基礎(chǔ)研究的深入，血清HBsAg定量檢測(cè)及其臨床意義已成為乙肝研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。現(xiàn)已明確，血清HBsAg可間接反映肝內(nèi)共價(jià)閉合環(huán)狀DNA數(shù)量和轉(zhuǎn)錄活性，其血清學(xué)水平與HBV慢性感染自然史密切相關(guān)，有助于區(qū)分乙肝e抗原(HBeAg)陰性慢性乙型肝炎(CHB)與非活動(dòng)性HBsAg攜帶者，也能幫助預(yù)測(cè)抗病毒藥物尤其

2、是干擾素(IFN)治療的持久病毒學(xué)應(yīng)答，但受HBsAg定量檢測(cè)方法和肝活檢技術(shù)普及不夠的影響，其與肝臟病理尤其是肝纖維化間的關(guān)聯(lián)如何、能否作為肝纖維化無(wú)創(chuàng)診斷的血清標(biāo)志物尚不清楚。另外一個(gè)來(lái)自HBsAg的挑戰(zhàn)是，目前臨床使用的兩類抗病毒藥核苷（酸）類似物(NUCs)和兼有免疫調(diào)節(jié)作用的IFNs對(duì)HBsAg作用非常有限一作為理想的抗病毒治療目標(biāo)，HBsAg血清學(xué)陰轉(zhuǎn)在臨床實(shí)踐中通常很難實(shí)現(xiàn)（1年抗病毒治療＜7％），尋找能降低HBsAg水平

3、的新藥或兼有降低HBsAg作用的抗HBV藥物是抗HBV新藥研究迫切需要解決的問(wèn)題之一，但目前只有幾種四氫-四唑-并嘧啶衍生物在實(shí)驗(yàn)研究中顯示出特異性抑制HBsAg分泌的作用。借助宿主肝細(xì)胞代謝-病毒間相互作用進(jìn)行HBV基因組轉(zhuǎn)錄調(diào)控的干預(yù)措施似乎在這一方面具有一定優(yōu)勢(shì)，尤其是現(xiàn)有相關(guān)臨床藥物的老藥新用開發(fā)。因此，本研究以血清HBsAg定量在肝纖維化無(wú)創(chuàng)診斷中的臨床意義和降低HBsAg水平的新藥研究為中心進(jìn)行設(shè)計(jì)，分成血清HBsAg定量檢

4、測(cè)在HBeAg陽(yáng)性慢性HBV感染者顯著性和進(jìn)展性肝纖維化預(yù)測(cè)中的價(jià)值、二甲雙胍對(duì)HBsAg表達(dá)和HBV復(fù)制影響的體外研究和二甲雙胍抑制HBsAg生成的可能機(jī)制研究等三部分進(jìn)行實(shí)施，主要目的在于:1）探討血清HBsAg定量檢測(cè)在HBeAg陽(yáng)性慢性HBV感染者肝纖維化無(wú)創(chuàng)診斷中的可能臨床價(jià)值;2）從肝臟代謝調(diào)控入手，觀察傳統(tǒng)口服降糖藥二甲雙胍在HBV穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型中對(duì)HBsAg表達(dá)和HBV復(fù)制的影響;3）從宿主肝細(xì)胞AMP活化蛋

5、白激酶(AMPK)和HBV基因組啟動(dòng)子/增強(qiáng)子轉(zhuǎn)錄活性兩方面初步探討二甲雙胍抑制HBsAg生成的可能機(jī)制，為擴(kuò)充血清HBsAg定量檢測(cè)的臨床意義提供新的觀察依據(jù)，為尋找降低HBsAg水平的新的治療選擇提供新的思路。
　　在第一部分工作中，我們收集了一組有組織學(xué)證實(shí)的HBeAg陽(yáng)性HBV慢性感染者(n=197)的臨床和病理資料，分析了血清HBsAg水平與肝臟病理間的聯(lián)系，并與兩個(gè)較常用的肝病病因非特異無(wú)創(chuàng)診斷模型FIB-4和APRI

6、相比較，重點(diǎn)評(píng)價(jià)了血清定量HBsAg(qHBsAg)或基于qHBsAg建立的簡(jiǎn)易模型在顯著性和進(jìn)展性肝纖維化預(yù)測(cè)中的價(jià)值。血清qHBsAg采用ArchitectHBsAgQT商業(yè)化試劑盒以免疫化學(xué)發(fā)光法在ARCHITECTi2000全自動(dòng)免疫分析儀上檢測(cè);肝臟纖維化分期采用Scheuer，s分類標(biāo)準(zhǔn)，顯著性肝纖維化定義為F2～F4，進(jìn)展性肝纖維化定義為F3～F4;基于qHBsAg建立的纖維化無(wú)創(chuàng)評(píng)估模型來(lái)自對(duì)建模隊(duì)列（隨機(jī)獲取研究對(duì)象總

7、體的60％生成）的多元分析，并在驗(yàn)證隊(duì)列即其余40％人群中進(jìn)行診斷效力的驗(yàn)證;以受試者工作特征(ROC)曲線下面積(AUC)計(jì)算所用模型的診斷準(zhǔn)確性。結(jié)果發(fā)現(xiàn):1）血清HBsAg水平與HBeAg陽(yáng)性HBV慢性感染者肝纖維化分期呈明顯的負(fù)相關(guān)，是預(yù)測(cè)顯著性和進(jìn)展性肝纖維化存在的獨(dú)立因子;2）基于血清qHBsAg建立的簡(jiǎn)易模型，尤其是與GGT聯(lián)合組成的GqHBsR，可以較準(zhǔn)確和特異地識(shí)別HBeAg陽(yáng)性HBV慢性感染者的顯著性肝纖維化，當(dāng)診斷

8、界值取7.78時(shí)診斷準(zhǔn)確性52.7％，在整個(gè)研究人群中預(yù)測(cè)顯著性肝纖維化的敏感性78.6％、特異性74.1％、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值(PPV)80％、陰性預(yù)測(cè)值72.4％，在我們的研究隊(duì)列中，可減少約80％的肝活檢需求;3）GqHBsR計(jì)分為8.84時(shí)診斷進(jìn)展性肝纖維化的準(zhǔn)確性最高(56.1％)，在整個(gè)研究人群中預(yù)測(cè)進(jìn)展性肝纖維化的敏感性83.3％、特異性66.4％;4）與目前較常用的肝病病因非特異性無(wú)創(chuàng)預(yù)測(cè)模型APRI和FIB-4相比，模型GqH

9、BsR的診斷準(zhǔn)確性明顯提高，并且具有不可替代的特異性、簡(jiǎn)單易獲得和高PPV等優(yōu)點(diǎn)，無(wú)論是診斷還是排除顯著性/進(jìn)展性肝纖維化都具有較大臨床價(jià)值。因此血清qHBsAg為HBeAg陽(yáng)性HBV慢性感染人群的顯著性或進(jìn)展性肝纖維化預(yù)測(cè)提供了一個(gè)簡(jiǎn)單實(shí)用的臨床評(píng)估工具。
　　在第二部分工作中，我們?cè)隗w外實(shí)驗(yàn)中比較了幾個(gè)臨床常用肝臟代謝調(diào)節(jié)藥（二甲雙胍、吡格列酮、阿托伐他汀和辛伐他?。?duì)整合有HBV基因組的穩(wěn)定細(xì)胞系HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)

10、上清液HBsAg表達(dá)的影響后，重點(diǎn)觀察了傳統(tǒng)口服降糖藥二甲雙胍對(duì)HBsAg表達(dá)和HBV復(fù)制的抑制作用。胞外和胞內(nèi)HBsAg均采用ArchitectHBsAgQT商業(yè)化試劑盒以免疫化學(xué)發(fā)光法在ARCHITECTi2000全自動(dòng)免疫分析儀上定量以便于抑制效果的比較;同法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液HBeAg表達(dá);熒光定量PCR法檢測(cè)胞外HBVDNA;Southernblot檢測(cè)胞內(nèi)HBV復(fù)制中間體。結(jié)果發(fā)現(xiàn):1）在HBV感染體外模型中，肝臟代謝調(diào)節(jié)類

11、藥物確實(shí)可以一定程度實(shí)現(xiàn)HBsAg表達(dá)的下調(diào)，但其效應(yīng)并不一致，在所選的幾個(gè)臨床常用藥物中，二甲雙胍抑制HepG2.2.15細(xì)胞胞外HBsAg表達(dá)的作用似乎最強(qiáng);2)隨后進(jìn)行的系統(tǒng)研究表明二甲雙胍能明顯抑制HBsAg生成并中等度抑制HBV復(fù)制和HBeAg表達(dá)，無(wú)論是在HBV穩(wěn)定轉(zhuǎn)染還是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞模型中;3）根據(jù)HBsAg定量結(jié)果計(jì)算二甲雙胍抑制HepG2.2.15細(xì)胞胞外和胞內(nèi)HBsAg表達(dá)的半數(shù)有效劑量(EC50)分別為2

12、.85mM和2.75mM，選擇指數(shù)(SI)分別等于17.8和18.4，在p1.3HBV瞬轉(zhuǎn)HepG2細(xì)胞中相應(yīng)EC50值分別為1.82mM和1.62mM，SI為30和33.7;4）當(dāng)聯(lián)合給藥時(shí)，二甲雙胍還能為現(xiàn)有兩類抗病毒藥拉米夫定和IFN-α2b提供降低HBsAg表達(dá)的補(bǔ)充作用和抑制病毒復(fù)制的協(xié)同作用。綜合考慮目前NUCs對(duì)降低HBsAg水平療效的明顯不足和我們觀察到的二甲雙胍的作用特點(diǎn)，我們認(rèn)為，二甲雙胍作為直接的HBsAg生成抑制

13、劑或輔助抗HBV藥與NUCs聯(lián)合應(yīng)用可能有助于提高臨床抗病毒治療的血清HBsAg陰轉(zhuǎn)率。
　　在第三部分工作中，我們從病毒和宿主兩個(gè)方面對(duì)二甲雙胍抑制HBsAg生成的可能機(jī)制進(jìn)行了初步研究。采用Luciferaseassay測(cè)定HBV啟動(dòng)子/增強(qiáng)子報(bào)告基因熒光素酶活性;Northernblot檢測(cè)胞內(nèi)HBVRNAs表達(dá);Westernblot檢測(cè)胞內(nèi)AMPK和HNF4α表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn):1）分別在HepG2細(xì)胞中瞬轉(zhuǎn)Sp1、Sp2、

14、ENⅡ/Cp、ENⅠ/Xp等4個(gè)HBV啟動(dòng)子/增強(qiáng)子報(bào)告基因質(zhì)粒后，二甲雙胍對(duì)熒光素酶活性表現(xiàn)出一致的明顯抑制作用;2）與報(bào)告基因熒光素酶活性的下降一致，二甲雙胍可明顯抑制HBV基因組(3.5kbpgRNA)和亞基因組(2.4/2.1kbsRNAs)的轉(zhuǎn)錄，可能與HBV復(fù)制方式的不同有關(guān)，這一效應(yīng)在p1.3HBV瞬轉(zhuǎn)模型中更為明顯;3）在p1.3HBV瞬轉(zhuǎn)HepG2細(xì)胞模型中，以AMPK抑制劑小分子化合物CompoundC與二甲雙胍共同

15、進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示CompoundC能明顯干擾二甲雙胍對(duì)HBV基因組和亞基因組的轉(zhuǎn)錄負(fù)調(diào)作用，但似乎不影響二甲雙胍對(duì)HBsAg生成的抑制效應(yīng);4）同樣在p1.3HBV瞬轉(zhuǎn)HepG2細(xì)胞模型中共轉(zhuǎn)pCMV-HNF4α以使核受體HNF4α過(guò)表達(dá)，可明顯干擾二甲雙胍對(duì)HBV基因組和亞基因組的轉(zhuǎn)錄負(fù)調(diào)作用以及二甲雙胍對(duì)HBsAg生成的抑制效應(yīng);5)二甲雙胍可抑制轉(zhuǎn)錄因子CRE、NFκβ啟動(dòng)子報(bào)告基因的熒光素酶活性，并且對(duì)不含HBV調(diào)控序列(Sp

16、1、Sp2)的S基因攜帶質(zhì)粒pCMV-SHBs瞬轉(zhuǎn)HepG2細(xì)胞的HBsAg表達(dá)僅有輕微的抑制趨勢(shì)。這些結(jié)果提示，二甲雙胍對(duì)HBsAg生成的抑制可能主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平，并且至少部分經(jīng)由肝細(xì)胞AMPK信號(hào)通路(AMPK活化進(jìn)而下調(diào)HNF4α活性)介導(dǎo)的HBV基因組/亞基因組轉(zhuǎn)錄調(diào)控實(shí)現(xiàn)，但宿主-病毒間精確的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制需要進(jìn)一步研究闡明。此外，CompoundC不夠特異的AMPK信號(hào)阻斷作用也需要我們聯(lián)合AMPK結(jié)構(gòu)性表達(dá)腺病毒/靶向si