人參皂甙Rg3對(duì)不同氧供條件下人喉鱗癌細(xì)胞（Hep-2）的增殖及HIF-1α和VEGF表達(dá)的影響.pdf

1、目的：探討人參皂甙Rg3在常氧、低氧條件下對(duì)人喉鱗癌細(xì)胞(Htep-2)增殖與凋亡的作用，以及對(duì)缺氧誘導(dǎo)因子-1α(Hypoxia Inducible Factor 1 alpha，HIF-1α)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)表達(dá)的影響，為中藥治療喉鱗癌以及以低氧作為喉鱗癌治療的新靶點(diǎn)提供重要的研究依據(jù)。 方法：模擬低氧條件(37℃，5％CO2，1％O2，94％N

2、2)，以人參皂甙Rg3作為干預(yù)因素，選擇順鉑作為陽(yáng)性對(duì)照。將人喉鱗癌細(xì)胞(Hep-2)分為六組，即A：常氧對(duì)照組；B：常氧人參皂甙Rg3組；C：常氧順鉑對(duì)照組；D：低氧對(duì)照組；E：低氧人參皂甙Rg3組；F：低氧順鉑對(duì)照組。采用MTT法分別檢測(cè)不同濃度的人參皂甙Rg3和順鉑在不同作用時(shí)間下對(duì)人喉鱗癌細(xì)胞(Hep-2)增殖的抑制作用，以確定本實(shí)驗(yàn)的最佳實(shí)驗(yàn)濃度與時(shí)間。采用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)不同氧條

3、件下，藥物作用后細(xì)胞凋亡情況；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)人參皂甙Rg3在不同氧條件下對(duì)Hep-2細(xì)胞周期以及凋亡的影響；采用RT-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)以及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)人參皂甙Rg3在不同氧條件下對(duì)HIF-1α和VEGF mRNA及蛋白表達(dá)的影響。 結(jié)果： 1.人參皂甙Rg3及順鉑在不同氧條件下對(duì)Hep-2細(xì)胞生長(zhǎng)的影響MTT結(jié)果顯示：人參皂甙Rg3在低氧、常氧條件下對(duì)人喉鱗癌細(xì)胞Hep-2的生長(zhǎng)均有抑制作用，且隨著Rg3作用濃

4、度的增加，抑制作用增強(qiáng)。各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比均有顯著差異(P＜0.05)；并且Rg3低氧條件下對(duì)人喉鱗癌細(xì)胞Hep-2的抑制率低于常氧條件下對(duì)人喉鱗癌細(xì)胞Hep-2的抑制率。 常氧條件下，順鉑3μg/ml的對(duì)Hep-2的抑制率(21.40±2.03)％與Rg3 300μg/ml的抑制率(19.71±1.32)％無(wú)顯著性差別(P＞0.05)，所以選擇順鉑3μg/ml、Rg3 300μg/ml作為實(shí)驗(yàn)濃度。300μg/ml濃度下的人

5、參皂甙Rg3分別作用12h、24h、48h和72h后，對(duì)人喉鱗癌細(xì)胞的抑制率無(wú)顯著性差異。因此，選擇24h作為作用時(shí)間。 2.人參皂甙Rg3及順鉑在不同氧條件下對(duì)Hep-2細(xì)胞周期的影響常氧培養(yǎng)細(xì)胞周期分布以G1期為主，S期次之，G2/M期最少；低氧條件下處于G0/G1期的細(xì)胞明顯增多，S期和G2/M期細(xì)胞減少。Rg3處理后，低氧、常氧兩種培養(yǎng)條件下的細(xì)胞分布G0/G1期細(xì)胞減少，S期和G2/M期細(xì)胞增多(P＜0.05)。

6、 3.人參皂甙Rg3及順鉑在不同氧條件下對(duì)Hep-2細(xì)胞凋亡的影響經(jīng)TUNEL染色，常氧、低氧條件下，用藥組均可見(jiàn)大量凋亡細(xì)胞，呈褐色，細(xì)胞圓形或梭形；低氧Rg3組凋亡指數(shù)(AI)(13.78±0.53)％明顯高于低氧對(duì)照組(1.02±0.2)％，但低于常氧Rg3組(18.15±0.96)％。 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，低氧、常氧兩種培養(yǎng)條件下，Rg3組凋亡率較對(duì)照組明顯增加(P＜0.05)，且低氧Rg3組凋亡率(7.62±0.95

7、)％低于常氧Rg3組(16.58±0.55)％(P＜0.05)。 4.人參皂甙Rg3及順鉑在不同氧條件下對(duì)Hep-2中HIF-1α表達(dá)的影響RT-PCR結(jié)果顯示低氧條件下，HIF-1α mRNA的表達(dá)明顯高于常氧。低氧條件下，Rg3組降低了HIF-1α mRNA的表達(dá)(P＜0.05)，順鉑組與對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。 免疫細(xì)胞化學(xué)和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果均顯示，低氧條件下，HIF-1α蛋白的表達(dá)明顯高于常氧；Rg

8、3和順鉑組中HIF-1α蛋白的表達(dá)弱于對(duì)照組(P＜0.05)，Rg3組與順鉑組之間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。 5.人參皂甙Rg3及順鉑在不同氧條件下對(duì)Hep-2中VEGF表達(dá)的影響RT-PCR結(jié)果可見(jiàn)低氧條件下， VEGF mRNA的表達(dá)明顯高于常氧。低氧條件下，Rg3組降低了VEGF mRNA的表達(dá)(P＜0.05)，順鉑組與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。 免疫細(xì)胞化學(xué)和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果均顯示，低氧條件下，V

9、EGF蛋白的表達(dá)明顯高于常氧；Rg3和順鉑組中VEGF蛋白的表達(dá)弱于對(duì)照組(P＜0.05)，Rg3組與順鉑組之間無(wú)顯著性差別(P＞0.05)。 6.經(jīng)Pearson相關(guān)性統(tǒng)計(jì)分析，HIF-1α和VEGF蛋白的表達(dá)呈顯著正相關(guān)；低氧條件下，HIF-1α蛋白的表達(dá)與Hep-2細(xì)胞的凋亡率呈顯著負(fù)相關(guān)。 結(jié)論： 1.在常氧、低氧不同氧供條件下，人參皂甙Rg3可以通過(guò)作用于Hep-2的G2-M期，阻斷細(xì)胞S-G2期、G2