片葉苔素D藥動(dòng)學(xué)、質(zhì)量控制及衍生物的合成研究.pdf

1、片葉苔素D是從中國(guó)苔類植物Dumortiera hirsute中分離得到的雙聯(lián)芐類化合物。生物活性研究顯示，片葉苔素D在體內(nèi)外均有良好的抗真菌、抗腫瘤活性。抗真菌方面，片葉苔素D通過(guò)下調(diào)菌絲特異基因，從而抑制菌絲生長(zhǎng)，影響生物膜形成，對(duì)白色念珠菌產(chǎn)生較好的抗真菌活性，更引人注意的是片葉苔素D對(duì)氟康唑耐藥菌株表現(xiàn)相同的抗真菌活性，提示片葉苔素D是一個(gè)潛在的抗真菌劑;抗腫瘤方面，片葉苔素D與已進(jìn)入臨床階段的抗腫瘤藥Combrastatin

2、A4結(jié)構(gòu)相似，均屬于聯(lián)芐類化合物，提示它可能的抗腫瘤活性。體外研究發(fā)現(xiàn)，片葉苔素D通過(guò)抑制微管蛋白形成、抑制腫瘤血管生長(zhǎng)等方式對(duì)KB、MCF-7、PC3等多個(gè)腫瘤細(xì)胞系產(chǎn)生抑制作用;在體內(nèi)，片葉苔素D對(duì)人白血病細(xì)胞HL-60產(chǎn)生明顯抑制作用，但對(duì)相應(yīng)的拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ缺乏的HL-60/MX2細(xì)胞無(wú)明顯抑制作用，說(shuō)明片葉苔素D可選擇性抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ活性，與已上市的抗腫瘤藥、拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ抑制劑etoposide（依托泊苷，表鬼臼毒吡喃葡萄糖苷

3、）相比，對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ有更強(qiáng)的抑制作用;通過(guò)將人肺癌細(xì)胞H460注入小鼠體內(nèi)的方式，建立肺癌小鼠模型，連續(xù)三周以20mg/Kg的劑量尾靜脈注射片葉苔素D，對(duì)照組靜注相同劑量etoposide，結(jié)果顯示，片葉苔素D抑瘤作用與etoposide相當(dāng)，且毒性遠(yuǎn)低于etoposide，無(wú)明顯毒性。根據(jù)體內(nèi)外研究結(jié)果，提示片葉苔素D可能是一種新型的拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ抑制劑，且毒性小于已上市的拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ抑制劑etoposide，說(shuō)明其具有良好的開(kāi)發(fā)前景

4、，目前課題組已完成片葉苔素D的全合成研究;針對(duì)片葉苔素D水溶性差，可能引起的口服生物利用度低的問(wèn)題，開(kāi)展了片葉苔素D納米晶體的研究。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴片葉苔素D代謝產(chǎn)物合成研究。完成了片葉苔素D葡萄糖苷的合成研究，為下一步片葉苔素D制劑藥動(dòng)學(xué)研究中片葉苔素D體內(nèi)代謝產(chǎn)物對(duì)照品的制備打下基礎(chǔ)，也為同類化合物的合成打下基礎(chǔ)。⑵片葉苔素D藥動(dòng)學(xué)、組織分布及排泄研究。建立了快速測(cè)定灌胃給藥和靜脈注射給藥后大鼠血漿、各組織、排泄物

5、中片葉苔素D原型的HPLC\MS\MS方法，并通過(guò)葡萄糖醛酸酶水解法測(cè)定了血漿及排泄物中片葉苔素D總量（原型加結(jié)合型），并計(jì)算出相關(guān)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。經(jīng)專一性、基質(zhì)效應(yīng)、絕對(duì)回收率、相對(duì)回收率、精密度、準(zhǔn)確度及穩(wěn)定性等確證建立的方法可用于生物樣本中片葉苔素D原型藥及總量測(cè)定;藥動(dòng)學(xué)結(jié)果顯示，片葉苔素D口服給藥后生物利用度較低，分別為:給藥劑量為20 mg/Kg時(shí)，生物利用度為13.4％，給藥劑量為40 mg/Kg時(shí)，生物利用度為6.2％，給藥

6、劑量為80 mg/Kg時(shí)，生物利用度為9.8％;按酶水解后片葉苔素D的總量計(jì)算，片葉苔素D總量的口服生物利用度分別為:給藥劑量為20 mg/Kg時(shí)，生物利用度為23.2％，給藥劑量為40 mg/Kg時(shí)，生物利用度為24.0％，給藥劑量為80 mg/Kg時(shí)，生物利用度為21.6％，即相同給藥劑量時(shí)片葉苔素D總量生物利用度高于原型藥，提示片葉苔素D吸收過(guò)程中可能發(fā)生較強(qiáng)的首過(guò)代謝而形成結(jié)合型代謝產(chǎn)物;組織分布研究顯示，口服給藥后，片葉苔素D

7、除在胃、小腸等消化道組織有較高濃度外，在其他組織分布濃度均較低;靜注給藥后，片葉苔素D在各組織中分布廣泛，尤其在肺中濃度較高，但在各組織消除迅速;靜脈及灌胃給藥后，片葉苔素D原型藥主要經(jīng)糞便排泄;片葉苔素D結(jié)合型主要經(jīng)膽汁排泄;尿樣中原型藥及結(jié)合型均較少;體內(nèi)代謝分析顯示，片葉苔素D體內(nèi)代謝產(chǎn)物主要為片葉苔素D結(jié)合一分子葡萄糖醛酸的Ⅱ相代謝產(chǎn)物，且互為異構(gòu)體;核磁共振波譜分析結(jié)合片葉苔素D的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，推斷兩個(gè)異構(gòu)體為旋阻異構(gòu);兩個(gè)異構(gòu)體

8、在室溫下存在相互轉(zhuǎn)化，直至達(dá)到約為1∶1的比例。⑶片葉苔素D P450酶體外抑制活性。采用熒光法、高通量P450酶抑制劑篩選試劑盒，測(cè)定片葉苔素D對(duì)人同工酶CYP1A2、CYP2C19及CYP3A4的抑制活性，片葉苔素D對(duì)CYP1A2活力抑制的IC50＞20μM，基本無(wú)抑制作用(IC50＞10μM)，對(duì)CYP2C19活力抑制作用IC50與相應(yīng)陽(yáng)性對(duì)照藥物基本一致，對(duì)CYP3A4活力抑制作用IC50較相應(yīng)陽(yáng)性藥物高，但仍屬于有抑制作用。⑷

9、片葉苔素D質(zhì)量控制方法研究。研究片葉苔素D質(zhì)量控制方法，通過(guò)方法學(xué)研究，確定片葉苔素D性狀外觀、溶解度、鑒別、檢查及含量測(cè)定方法并制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案。建立片葉苔素D紅外及高效液相色譜鑒別方法;高效液相色譜法測(cè)定片葉苔素D有關(guān)物質(zhì)及含量;氣相色譜法測(cè)定片葉苔素D殘留溶劑。
　　本研究通過(guò)建立快速、靈敏、選擇性好的HPLC-MS/MS方法測(cè)定血漿及十種組織中片葉苔素D的含量，經(jīng)方法學(xué)確證能滿足測(cè)定要求;準(zhǔn)確描述片葉苔素D在體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)

10、特征、組織分布、排泄情況，為其進(jìn)一步結(jié)構(gòu)修飾及劑型開(kāi)發(fā)提供藥動(dòng)學(xué)科學(xué)依據(jù):為克服較強(qiáng)的首過(guò)效應(yīng)，提高其藥效，應(yīng)在進(jìn)一步研究中關(guān)注片葉苔素D的結(jié)構(gòu)修飾、篩選適宜的的劑型;因片葉苔素D水中幾乎不溶，導(dǎo)致其口服生物利用度低，限制其應(yīng)用，故應(yīng)在目前課題組已開(kāi)展的片葉苔素D納米晶體研究的基礎(chǔ)上，作進(jìn)一步研究，以提高其溶解度;靜注結(jié)果顯示片葉苔素D在肺部有較多分布，與片葉苔素D體內(nèi)活性結(jié)果相符，提示片葉苔素D在治療肺癌方面具有可開(kāi)發(fā)性;片葉苔素D體